超氧化物歧化酶抑制精液來源的病毒增強因子形成的研究

邱夢婕，李釗鋒，黎奕斌，陳玉柳，程宏彥，劉叔文，譚穗懿

南方醫(yī)科大學藥學院，廣州510515

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是獲得性免疫缺陷綜合征即艾滋病的致病因子；艾滋病是全球十大致命疾病之一，目前已經(jīng)造成了超過2 500 萬人死亡，有超過3 000 萬病毒攜帶者［1-2］。性傳播已成為HIV 感染的主要傳播方式［3］，其中精液是性傳播環(huán)節(jié)中的重要媒介。精液中含量較高的前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase，PAP）裂解所產(chǎn)生的多肽PAP248-286 可通過自組裝形成淀粉樣纖維，即精液來源的病毒增強因子（semen-derived enhancer of viral infection，SEVI），SEVI 能夠極大地促進HIV 感染［4-6］。抑制PAP248-286 形成SEVI，可以有效地抑制SEVI 對HIV 病毒感染的增強作用［7-9］。因此，SEVI成為預(yù)防HIV性傳播的新靶點。在我們前期篩選SEVI 小分子抑制劑的研究［8，10-12］中，意外地發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）可抑制PAP248-286聚合形成SEVI且精液中天然存在SOD，因此，本研究主要圍繞SOD 對PAP248-286生成的影響展開。

SOD 是帶負電荷的金屬蛋白酶，在人體內(nèi)可以清除超氧自由基，能消除代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)［13-14］。SOD 在臨床上有廣泛的用途，能治療因自由基損害引起的疾?。?4］。SOD 在男性精液中普遍存在，但在不同疾病狀態(tài)的男性精液中其活性有所不同［15-20］。本研究使用多種生物物理化學方法，從不同層面探究SOD 對前體肽PAP248-286形成SEVI的抑制作用，探討其在精液中對人類免疫缺陷病毒1 型（HIV-1）感染的生理意義，為預(yù)防HIV的性傳播提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與質(zhì)粒 HEK-293T 人胚胎腎細胞、TZM-bl細胞（是一種攜帶有熒光素酶報告基因的傳代細胞系，并且該報告基因受HIV-1 Tat 原件調(diào)控，只有在HIV-1 Tat蛋白存在下才會表達，其熒光強度與HIV 滴度成正比）于本實驗室液氮中保存。感染性克隆病毒質(zhì)粒SF162（通過轉(zhuǎn)染能產(chǎn)生趨化因子受體CCR5 嗜性的HIV-1 克隆病毒）由烏爾姆大學Jan Münch教授惠贈。

1.1.2 精液的來源及處理 收集健康志愿者的精液（semen；seminal fluid，SE-F），室溫放置30 min，4 ℃，10 000×g離心30 min，取上清液，加入慶大霉素（50 μg/mL）、鏈霉素（100 U/mL）、青霉素（100 U/mL），存于?80 ℃待用。

1.1.3 主要試劑及儀器 SOD、總SOD 活性檢測試劑盒（上海碧云天），多肽PAP248-286（純度大于95%，北京中科亞光生物），轉(zhuǎn)染劑聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI，上海起福），細胞裂解液、熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega），DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Gibco），電鏡碳膜銅網(wǎng)（上海主流貿(mào)易），3%磷鎢酸（上海君瑞生物），胎牛血清（FBS，上海依科賽），硫磺素T（thioflavin T，ThT）及其他常規(guī)化學分析試劑（美國Sigma）。

Thermomixer 恒溫振蕩儀（德國Eppendorf），透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM，日本Hitachi），圓二色譜（circular dichroism，CD）儀（日本Jasco），Genios Pro 型酶標儀、多功能檢測酶標儀（美國Tecan），生物安全柜（新加坡ESCO）。

1.2 淀粉樣纖維SEVI形成的檢測方法

1.2.1 硫磺素T染色法 在440 μmol/L多肽PAP248-286溶液或精液中加入不同活性水平的SOD（23、46、92 U/mL），于37 ℃，200×g 的恒溫振蕩器中孵育，于不同時間點分別取樣10 μL 加入96 孔黑板中，再加入硫磺素T 溶液190 μL/孔，立即在酶標儀中檢測熒光強度（發(fā)射波長為485 nm，激發(fā)波長為440 nm）。

1.2.2 圓二色譜法 將含有不同活性水平SOD（23、46、92 U/mL）的440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶液混勻，于37 ℃，200 ×g 的恒溫振蕩器中孵育，在4 h 和48 h 時取樣；使用圓二色譜儀檢測樣品，樣品按PAP248-286 濃度稀釋至66 μmol/L，比色皿的光路為1 mm，掃描波長范圍為190～280 nm，波長間隔1.0 nm，掃描速度24 nm/min，檢測3 次后取平均值，最終圖譜為樣品圖譜減去溶劑（PBS）的圖譜。

1.2.3 TEM 觀察 在440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶 液中加入SOD（92 U/mL）混勻，于37 ℃，200×g的振蕩器中孵育，在4 h和48 h分別取樣；樣品按PAP248-286濃度稀釋至30 μmol/L，滴于銅網(wǎng)上，2 min 后用濾紙吸走多余的液體，然后用磷鎢酸溶液（3%，pH 7.0）染色2 min并用濾紙吸走多余液體，用超純水洗1次，待銅網(wǎng)自然干燥后，即可觀察淀粉樣纖維的形態(tài)。

1.3 病毒感染實驗

1.3.1 感染性克隆病毒的制備及滴度測定 將CCR5 受體嗜性克隆病毒質(zhì)粒與PEI 按1∶3 的比例（質(zhì)量與體積比）混勻后轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞，37 ℃轉(zhuǎn)染8 h 后更換新鮮的DMEM 完全培養(yǎng)基；48 h 后，收集細胞培養(yǎng)液，于1 500 ×g 離心15 min，取上清液，即得到HIV-1 克隆病毒，于?80 ℃保存?zhèn)溆?。將病毒液按不同比例稀釋，分別加入TZM-bl 細胞中，48 h 后用熒光素酶檢測試劑盒檢測病毒滴度［10］。

1.3.2 病毒感染能力的測定 取含有不等量SOD（23、46、92 U/mL）的440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶液，混勻，于37 ℃，200×g 的振蕩器中孵育，于0、2、4、8、12、24和48 h分別取樣凍存。將TZM-b1細胞接種于96孔板中（l×105/mL），37 ℃培養(yǎng)過夜；含有SOD 的PAP248-286 溶液樣品于700×g 室溫離心10 min，棄上清液，用空白培養(yǎng)基重懸樣品，病毒（12 ng/孔，以p24抗原計算）與樣品以1∶1的體積比混合均勻，室溫孵育5 min，將混合液加入細胞中，感染3 h后更換新鮮DMEM 培養(yǎng)基；48 h后，棄上清液，PBS清洗1次，使用熒光素酶檢測試劑盒檢測其化學發(fā)光值，計算病毒感染增強倍數(shù)［21-22］。

1.4 SOD滅活后的作用檢測

參考文獻［23-24］方法，采用水浴75 ℃加熱40 min滅活SOD，取等量的有活性和滅活的SOD（46 U/mL）加入440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶液中，重復(fù)上述硫磺素T染色法、圓二色譜法、病毒感染實驗。

1.5 精液中SOD活性的測定

按總SOD 活性檢測試劑盒說明書操作，簡述步驟如下：配制WST-8/酶工作液和反應(yīng)啟動工作液，依次在96 孔板中加入待測樣品、SOD 檢測緩沖液、WST-8/酶工作液和反應(yīng)啟動液，用振板器混勻，于37 ℃放置30 min后，檢測溶液450 nm 處的吸光度值，按說明書計算精液中的SOD活性水平。

1.6 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。定量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較符合方差齊性時采用LSD 法，方差不齊時采用Dunnett T3檢驗法。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SOD對PAP248-286形成SEVI的影響

硫磺素T 染色法結(jié)果如圖1A 所示：未加入SOD 的PAP248-286溶液在2 h時熒光強度已明顯升高，且隨時間逐漸升高，在24 h 后接近穩(wěn)定，說明多肽PAP248-286 生成了淀粉樣纖維，并逐漸增加。在加入不等量的SOD 體系中，SOD 呈劑量依賴性地抑制SEVI 的形成，92 U/mL SOD在48 h內(nèi)幾乎完全抑制SEVI的形成。

肽鏈的二級結(jié)構(gòu)有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊等特定立體結(jié)構(gòu)，每種構(gòu)象在圓二色譜圖都有特定的吸收峰，根據(jù)吸收特征峰可判斷肽鏈的結(jié)構(gòu)。淀粉樣纖維SEVI主要是β-折疊結(jié)構(gòu)，在220 nm附近有負峰。圓二色譜檢測結(jié)果如圖1B所示：在4 h時，各PAP248-286溶液反應(yīng)體系在220 nm附近均無明顯負峰，表明前體肽均未產(chǎn)生大量β-折疊結(jié)構(gòu)，即沒有形成大量SEVI。在反應(yīng)48 h 后，未加入SOD 的PAP248-286 溶液在220 nm 附近有明顯的負峰，表明此時溶液中已形成含β-折疊結(jié)構(gòu)的SEVI；而在加入了SOD 的溶液中仍未出現(xiàn)明顯負峰，即沒有形成大量的SEVI。

為了直觀地觀察SOD 對PAP248-286 形成SEVI 的影響，使用TEM 觀察淀粉樣纖維的形態(tài)。如圖1C 所示，4 h 時，單純PAP248-286 樣品在TEM 下可觀察到少量成熟纖維，而含有SOD 的多肽PAP248-286 溶液中未觀察到明顯纖維；48 h 時，單純PAP248-286 溶液中已經(jīng)形成大團的淀粉樣纖維，幾乎占滿整個視野，而加入了SOD 的樣品仍未觀察到纖維。

2.2 SOD抑制精液中淀粉樣纖維的形成

為了進一步探究SOD 對人體精液中PAP248-286 纖維化的影響，將健康志愿者的精液與不同活性水平的SOD混勻，振蕩孵育，于2 h、8 h取樣，經(jīng)硫磺素T 染色后測熒光強度。如圖2 所示，單純精液振蕩8 h 后其熒光值略有所增加，表明有新的淀粉樣纖維生成。在加入不同活性水平SOD 的體系中，SOD 可抑制精液中淀粉樣纖維的形成。

圖2 SOD對精液中淀粉樣纖維形成的抑制作用Fig 2 Inhibitory effect of SOD on the assembly of amyloid fibrils in SE-F

2.3 SOD對SEVI促進HIV-1感染能力作用的影響

結(jié)果如圖3 所示，隨著不同PAP248-286 溶液體系孵育時間的延長，病毒的感染增強倍數(shù)均逐漸增大，提示SEVI 形成的量越多，對病毒感染能力的增強作用越強；而SOD可抑制SEVI對病毒感染能力的增強作用，且SOD活性越高，抑制作用越強。

圖3 SOD對SEVI促進HIV-1感染能力的抑制作用Fig 3 Inhibition of SOD on the ability of SEVI to promote HIV-1 infection

2.4 滅活的SOD對PAP248-286形成SEVI的影響

將PAP248-286 溶液分別與等量未滅活或滅活的SOD振蕩孵育，硫磺素T 染色后檢測結(jié)果如圖4A 所示，加入滅活SOD與未加入SOD的PAP248-286溶液的熒光強度變化趨勢基本一致，48 h 時熒光強度均高于加入未滅活SOD的反應(yīng)體系。

在4 h和48 h分別取樣，圓二色譜法檢測β-折疊結(jié)構(gòu)。結(jié)果（圖4B）顯示48 h時，未加入SOD 及加入滅活SOD的PAP248-286 溶液均在220 nm 附近出現(xiàn)明顯的負峰，而加入未滅活SOD 的PAP248-286 溶液未出現(xiàn)明顯的吸收峰。

圖4 滅活的SOD對淀粉樣纖維SEVI形成的作用Fig 4 Effect of inactivated SOD on the assembly of SEVI amyloid fibrils

2.5 滅活的SOD對SEVI促進HIV-1感染能力作用的影響

分別檢測加入等量滅活與未滅活的SOD 后，不同孵育時間點的PAP248-286 溶液對病毒感染能力的影響。結(jié)果如圖5 所示，加入滅活SOD 的PAP248-286 溶液促進病毒感染的能力較加入未滅活SOD 的有所增強（P<0.05）， 但 略 弱 于 未 加 入SOD 的PAP248-286 溶 液（P>0.05）。

圖5 滅活SOD對SEVI促進病毒感染能力的作用Fig 5 Effect of inactivated SOD on the ability of SEVI to promote HIV-1 infection

2.6 人體精液中的SOD活性

使用總SOD 活性檢測試劑盒檢測5 份健康志愿者精液中SOD 的活性水平，其值分別為74.87、68.69、85.46、113.29、109.53 U/mL。

3 討論

精液中的淀粉樣纖維SEVI 在HIV-1 性傳播過程中可顯著促進HIV-1 的感染［5］，使其在近年來備受關(guān)注。本研究通過硫磺素T 熒光染色法、圓二色光譜法、TEM 觀察及病毒感染增強實驗均證實SOD 可抑制前體肽PAP248-286 形成淀粉樣纖維SEVI，進而拮抗SEVI 對HIV-1感染能力的促進作用。SOD是人體內(nèi)廣泛存在的一種金屬蛋白酶，酶的活性直接影響其生理功能。我們的實驗結(jié)果表明，等量滅活的SOD 不能抑制PAP248-286 形成SEVI，不能有效拮抗SEVI促HIV-1 感染的能力，說明SOD 抑制SEVI形成很可能與其活性有關(guān)，但具體的內(nèi)在機制有待進一步探究。

已有多項體外實驗揭示了人體中天然存在一些保護因子，對HIV-1的性傳播具有一定的抑制作用；例如女性陰道中的陽離子多肽（defensins）［25］、乳酸［26］，女性陰道分泌液和男性精液中的外泌體［27-28］。近年來，本課題組研究了人體中潛在的通過SEVI 抑制HIV 性傳播的因素。之前的研究［12］發(fā)現(xiàn)女性陰道中的乳酸具有抑制PAP248-286形成SEVI的作用。而本研究揭示了男性精液中天然存在的SOD 也具有抑制PAP248-286 聚合形成SEVI的作用。

根據(jù)相關(guān)文獻［5］的報道，正常人體精液中PAP248-286 的濃度為35 μg/mL；而本研究使用的PAP248-286 濃度為440 μmol/L，即2 mg/mL，遠高于正常人體精液中的濃度。在SOD 抑制SEVI 形成的實驗中發(fā)現(xiàn)，SOD 活性達到46 U/mL或以上即可發(fā)揮作用；而檢測的5份健康志愿者精液中SOD的活性均大于該水平。其他文獻［15］結(jié)果也證實，健康男性精液中SOD 的活性約為100 U/mL。故健康人體精液中SOD 的活性可以有效抑制PAP248-286 形成SEVI。然而，據(jù)相關(guān)報道［15］稱，不同疾病狀態(tài)的男性的精液中SOD 活性有所不同，如抗精子抗體陽性的男性不育患者的精液中SOD 活性可降至33.54 U/mL，其抑制SEVI形成的能力可能減弱。另外，男性生殖器炎癥疾病、性傳播病原體共感染等均會對精液SOD 活性產(chǎn)生影響［29-31］，提示這部分患者可能是HIV 性傳播的高風險人群，對HIV阻斷策略的設(shè)計及實施具有一定的指導(dǎo)意義。

因此，本研究的結(jié)果為預(yù)防HIV-1的性傳播提供了新的思路；同時也提示SOD 可能可以與其他抗病毒藥物聯(lián)合使用制成多效抗微生物劑，用于抑制HIV-1的性傳播。

參·考·文·獻

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