邱夢婕,李釗鋒,黎奕斌,陳玉柳,程宏彥,劉叔文,譚穗懿
南方醫(yī)科大學藥學院,廣州510515
人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征即艾滋病的致病因子;艾滋病是全球十大致命疾病之一,目前已經(jīng)造成了超過2 500 萬人死亡,有超過3 000 萬病毒攜帶者[1-2]。性傳播已成為HIV 感染的主要傳播方式[3],其中精液是性傳播環(huán)節(jié)中的重要媒介。精液中含量較高的前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase,PAP)裂解所產(chǎn)生的多肽PAP248-286 可通過自組裝形成淀粉樣纖維,即精液來源的病毒增強因子(semen-derived enhancer of viral infection,SEVI),SEVI 能夠極大地促進HIV 感染[4-6]。抑制PAP248-286 形成SEVI,可以有效地抑制SEVI 對HIV 病毒感染的增強作用[7-9]。因此,SEVI成為預(yù)防HIV性傳播的新靶點。在我們前期篩選SEVI 小分子抑制劑的研究[8,10-12]中,意外地發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)可抑制PAP248-286聚合形成SEVI且精液中天然存在SOD,因此,本研究主要圍繞SOD 對PAP248-286生成的影響展開。
SOD 是帶負電荷的金屬蛋白酶,在人體內(nèi)可以清除超氧自由基,能消除代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)[13-14]。SOD 在臨床上有廣泛的用途,能治療因自由基損害引起的疾?。?4]。SOD 在男性精液中普遍存在,但在不同疾病狀態(tài)的男性精液中其活性有所不同[15-20]。本研究使用多種生物物理化學方法,從不同層面探究SOD 對前體肽PAP248-286形成SEVI的抑制作用,探討其在精液中對人類免疫缺陷病毒1 型(HIV-1)感染的生理意義,為預(yù)防HIV的性傳播提供新的研究思路。
1.1.1 細胞與質(zhì)粒 HEK-293T 人胚胎腎細胞、TZM-bl細胞(是一種攜帶有熒光素酶報告基因的傳代細胞系,并且該報告基因受HIV-1 Tat 原件調(diào)控,只有在HIV-1 Tat蛋白存在下才會表達,其熒光強度與HIV 滴度成正比)于本實驗室液氮中保存。感染性克隆病毒質(zhì)粒SF162(通過轉(zhuǎn)染能產(chǎn)生趨化因子受體CCR5 嗜性的HIV-1 克隆病毒)由烏爾姆大學Jan Münch教授惠贈。
1.1.2 精液的來源及處理 收集健康志愿者的精液(semen;seminal fluid,SE-F),室溫放置30 min,4 ℃,10 000×g離心30 min,取上清液,加入慶大霉素(50 μg/mL)、鏈霉素(100 U/mL)、青霉素(100 U/mL),存于?80 ℃待用。
1.1.3 主要試劑及儀器 SOD、總SOD 活性檢測試劑盒(上海碧云天),多肽PAP248-286(純度大于95%,北京中科亞光生物),轉(zhuǎn)染劑聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI,上海起福),細胞裂解液、熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega),DMEM 高糖培養(yǎng)基(美國Gibco),電鏡碳膜銅網(wǎng)(上海主流貿(mào)易),3%磷鎢酸(上海君瑞生物),胎牛血清(FBS,上海依科賽),硫磺素T(thioflavin T,ThT)及其他常規(guī)化學分析試劑(美國Sigma)。
Thermomixer 恒溫振蕩儀(德國Eppendorf),透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM,日本Hitachi),圓二色譜(circular dichroism,CD)儀(日本Jasco),Genios Pro 型酶標儀、多功能檢測酶標儀(美國Tecan),生物安全柜(新加坡ESCO)。
1.2.1 硫磺素T染色法 在440 μmol/L多肽PAP248-286溶液或精液中加入不同活性水平的SOD(23、46、92 U/mL),于37 ℃,200×g 的恒溫振蕩器中孵育,于不同時間點分別取樣10 μL 加入96 孔黑板中,再加入硫磺素T 溶液190 μL/孔,立即在酶標儀中檢測熒光強度(發(fā)射波長為485 nm,激發(fā)波長為440 nm)。
1.2.2 圓二色譜法 將含有不同活性水平SOD(23、46、92 U/mL)的440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶液混勻,于37 ℃,200 ×g 的恒溫振蕩器中孵育,在4 h 和48 h 時取樣;使用圓二色譜儀檢測樣品,樣品按PAP248-286 濃度稀釋至66 μmol/L,比色皿的光路為1 mm,掃描波長范圍為190~280 nm,波長間隔1.0 nm,掃描速度24 nm/min,檢測3 次后取平均值,最終圖譜為樣品圖譜減去溶劑(PBS)的圖譜。
1.2.3 TEM 觀察 在440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶 液中加入SOD(92 U/mL)混勻,于37 ℃,200×g的振蕩器中孵育,在4 h和48 h分別取樣;樣品按PAP248-286濃度稀釋至30 μmol/L,滴于銅網(wǎng)上,2 min 后用濾紙吸走多余的液體,然后用磷鎢酸溶液(3%,pH 7.0)染色2 min并用濾紙吸走多余液體,用超純水洗1次,待銅網(wǎng)自然干燥后,即可觀察淀粉樣纖維的形態(tài)。
1.3.1 感染性克隆病毒的制備及滴度測定 將CCR5 受體嗜性克隆病毒質(zhì)粒與PEI 按1∶3 的比例(質(zhì)量與體積比)混勻后轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞,37 ℃轉(zhuǎn)染8 h 后更換新鮮的DMEM 完全培養(yǎng)基;48 h 后,收集細胞培養(yǎng)液,于1 500 ×g 離心15 min,取上清液,即得到HIV-1 克隆病毒,于?80 ℃保存?zhèn)溆?。將病毒液按不同比例稀釋,分別加入TZM-bl 細胞中,48 h 后用熒光素酶檢測試劑盒檢測病毒滴度[10]。
1.3.2 病毒感染能力的測定 取含有不等量SOD(23、46、92 U/mL)的440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶液,混勻,于37 ℃,200×g 的振蕩器中孵育,于0、2、4、8、12、24和48 h分別取樣凍存。將TZM-b1細胞接種于96孔板中(l×105/mL),37 ℃培養(yǎng)過夜;含有SOD 的PAP248-286 溶液樣品于700×g 室溫離心10 min,棄上清液,用空白培養(yǎng)基重懸樣品,病毒(12 ng/孔,以p24抗原計算)與樣品以1∶1的體積比混合均勻,室溫孵育5 min,將混合液加入細胞中,感染3 h后更換新鮮DMEM 培養(yǎng)基;48 h后,棄上清液,PBS清洗1次,使用熒光素酶檢測試劑盒檢測其化學發(fā)光值,計算病毒感染增強倍數(shù)[21-22]。
參考文獻[23-24]方法,采用水浴75 ℃加熱40 min滅活SOD,取等量的有活性和滅活的SOD(46 U/mL)加入440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶液中,重復(fù)上述硫磺素T染色法、圓二色譜法、病毒感染實驗。
按總SOD 活性檢測試劑盒說明書操作,簡述步驟如下:配制WST-8/酶工作液和反應(yīng)啟動工作液,依次在96 孔板中加入待測樣品、SOD 檢測緩沖液、WST-8/酶工作液和反應(yīng)啟動液,用振板器混勻,于37 ℃放置30 min后,檢測溶液450 nm 處的吸光度值,按說明書計算精液中的SOD活性水平。
應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。定量資料用±s表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較符合方差齊性時采用LSD 法,方差不齊時采用Dunnett T3檢驗法。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
硫磺素T 染色法結(jié)果如圖1A 所示:未加入SOD 的PAP248-286溶液在2 h時熒光強度已明顯升高,且隨時間逐漸升高,在24 h 后接近穩(wěn)定,說明多肽PAP248-286 生成了淀粉樣纖維,并逐漸增加。在加入不等量的SOD 體系中,SOD 呈劑量依賴性地抑制SEVI 的形成,92 U/mL SOD在48 h內(nèi)幾乎完全抑制SEVI的形成。
肽鏈的二級結(jié)構(gòu)有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊等特定立體結(jié)構(gòu),每種構(gòu)象在圓二色譜圖都有特定的吸收峰,根據(jù)吸收特征峰可判斷肽鏈的結(jié)構(gòu)。淀粉樣纖維SEVI主要是β-折疊結(jié)構(gòu),在220 nm附近有負峰。圓二色譜檢測結(jié)果如圖1B所示:在4 h時,各PAP248-286溶液反應(yīng)體系在220 nm附近均無明顯負峰,表明前體肽均未產(chǎn)生大量β-折疊結(jié)構(gòu),即沒有形成大量SEVI。在反應(yīng)48 h 后,未加入SOD 的PAP248-286 溶液在220 nm 附近有明顯的負峰,表明此時溶液中已形成含β-折疊結(jié)構(gòu)的SEVI;而在加入了SOD 的溶液中仍未出現(xiàn)明顯負峰,即沒有形成大量的SEVI。
為了直觀地觀察SOD 對PAP248-286 形成SEVI 的影響,使用TEM 觀察淀粉樣纖維的形態(tài)。如圖1C 所示,4 h 時,單純PAP248-286 樣品在TEM 下可觀察到少量成熟纖維,而含有SOD 的多肽PAP248-286 溶液中未觀察到明顯纖維;48 h 時,單純PAP248-286 溶液中已經(jīng)形成大團的淀粉樣纖維,幾乎占滿整個視野,而加入了SOD 的樣品仍未觀察到纖維。
為了進一步探究SOD 對人體精液中PAP248-286 纖維化的影響,將健康志愿者的精液與不同活性水平的SOD混勻,振蕩孵育,于2 h、8 h取樣,經(jīng)硫磺素T 染色后測熒光強度。如圖2 所示,單純精液振蕩8 h 后其熒光值略有所增加,表明有新的淀粉樣纖維生成。在加入不同活性水平SOD 的體系中,SOD 可抑制精液中淀粉樣纖維的形成。
圖2 SOD對精液中淀粉樣纖維形成的抑制作用Fig 2 Inhibitory effect of SOD on the assembly of amyloid fibrils in SE-F
結(jié)果如圖3 所示,隨著不同PAP248-286 溶液體系孵育時間的延長,病毒的感染增強倍數(shù)均逐漸增大,提示SEVI 形成的量越多,對病毒感染能力的增強作用越強;而SOD可抑制SEVI對病毒感染能力的增強作用,且SOD活性越高,抑制作用越強。
圖3 SOD對SEVI促進HIV-1感染能力的抑制作用Fig 3 Inhibition of SOD on the ability of SEVI to promote HIV-1 infection
將PAP248-286 溶液分別與等量未滅活或滅活的SOD振蕩孵育,硫磺素T 染色后檢測結(jié)果如圖4A 所示,加入滅活SOD與未加入SOD的PAP248-286溶液的熒光強度變化趨勢基本一致,48 h 時熒光強度均高于加入未滅活SOD的反應(yīng)體系。
在4 h和48 h分別取樣,圓二色譜法檢測β-折疊結(jié)構(gòu)。結(jié)果(圖4B)顯示48 h時,未加入SOD 及加入滅活SOD的PAP248-286 溶液均在220 nm 附近出現(xiàn)明顯的負峰,而加入未滅活SOD 的PAP248-286 溶液未出現(xiàn)明顯的吸收峰。
圖4 滅活的SOD對淀粉樣纖維SEVI形成的作用Fig 4 Effect of inactivated SOD on the assembly of SEVI amyloid fibrils
分別檢測加入等量滅活與未滅活的SOD 后,不同孵育時間點的PAP248-286 溶液對病毒感染能力的影響。結(jié)果如圖5 所示,加入滅活SOD 的PAP248-286 溶液促進病毒感染的能力較加入未滅活SOD 的有所增強(P<0.05), 但 略 弱 于 未 加 入SOD 的PAP248-286 溶 液(P>0.05)。
圖5 滅活SOD對SEVI促進病毒感染能力的作用Fig 5 Effect of inactivated SOD on the ability of SEVI to promote HIV-1 infection
使用總SOD 活性檢測試劑盒檢測5 份健康志愿者精液中SOD 的活性水平,其值分別為74.87、68.69、85.46、113.29、109.53 U/mL。
精液中的淀粉樣纖維SEVI 在HIV-1 性傳播過程中可顯著促進HIV-1 的感染[5],使其在近年來備受關(guān)注。本研究通過硫磺素T 熒光染色法、圓二色光譜法、TEM 觀察及病毒感染增強實驗均證實SOD 可抑制前體肽PAP248-286 形成淀粉樣纖維SEVI,進而拮抗SEVI 對HIV-1感染能力的促進作用。SOD是人體內(nèi)廣泛存在的一種金屬蛋白酶,酶的活性直接影響其生理功能。我們的實驗結(jié)果表明,等量滅活的SOD 不能抑制PAP248-286 形成SEVI,不能有效拮抗SEVI促HIV-1 感染的能力,說明SOD 抑制SEVI形成很可能與其活性有關(guān),但具體的內(nèi)在機制有待進一步探究。
已有多項體外實驗揭示了人體中天然存在一些保護因子,對HIV-1的性傳播具有一定的抑制作用;例如女性陰道中的陽離子多肽(defensins)[25]、乳酸[26],女性陰道分泌液和男性精液中的外泌體[27-28]。近年來,本課題組研究了人體中潛在的通過SEVI 抑制HIV 性傳播的因素。之前的研究[12]發(fā)現(xiàn)女性陰道中的乳酸具有抑制PAP248-286形成SEVI的作用。而本研究揭示了男性精液中天然存在的SOD 也具有抑制PAP248-286 聚合形成SEVI的作用。
根據(jù)相關(guān)文獻[5]的報道,正常人體精液中PAP248-286 的濃度為35 μg/mL;而本研究使用的PAP248-286 濃度為440 μmol/L,即2 mg/mL,遠高于正常人體精液中的濃度。在SOD 抑制SEVI 形成的實驗中發(fā)現(xiàn),SOD 活性達到46 U/mL或以上即可發(fā)揮作用;而檢測的5份健康志愿者精液中SOD的活性均大于該水平。其他文獻[15]結(jié)果也證實,健康男性精液中SOD 的活性約為100 U/mL。故健康人體精液中SOD 的活性可以有效抑制PAP248-286 形成SEVI。然而,據(jù)相關(guān)報道[15]稱,不同疾病狀態(tài)的男性的精液中SOD 活性有所不同,如抗精子抗體陽性的男性不育患者的精液中SOD 活性可降至33.54 U/mL,其抑制SEVI形成的能力可能減弱。另外,男性生殖器炎癥疾病、性傳播病原體共感染等均會對精液SOD 活性產(chǎn)生影響[29-31],提示這部分患者可能是HIV 性傳播的高風險人群,對HIV阻斷策略的設(shè)計及實施具有一定的指導(dǎo)意義。
因此,本研究的結(jié)果為預(yù)防HIV-1的性傳播提供了新的思路;同時也提示SOD 可能可以與其他抗病毒藥物聯(lián)合使用制成多效抗微生物劑,用于抑制HIV-1的性傳播。
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