FBXO22 調(diào)控凋亡誘導(dǎo)因子的分子機(jī)制及其在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用

劉朦迪，潘漪蓮，朱曉娜，楊 爍，楊 茜，余 韻

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)中心，上海200025；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院生殖遺傳科，上海200030；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院產(chǎn)科，上海200030

泛素化是一種由激活酶E1、結(jié)合酶E2 和連接酶E3構(gòu)成的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可與蛋白酶體組成泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)真核細(xì)胞內(nèi)約80%的蛋白質(zhì)降解或功能改變，其中連接酶E3 負(fù)責(zé)特異性識(shí)別及結(jié)合底物［1-2］。SKP1-CUL1-F-box（SCF）復(fù)合體是真核細(xì)胞中研究最多的E3連接酶，由支架蛋白CUL1、RING 型鋅指蛋白、銜接蛋白S-期激酶關(guān)聯(lián)蛋白1（S-phase kinase associated protein 1，SKP1）和底物招募蛋白F-box組成［3］。

F-box蛋白有2個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，即F-box結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；F-box蛋白可通過(guò)F-box結(jié)構(gòu)域與SKP1相連，進(jìn)而與CUL1、RING 等結(jié)合形成SCF 復(fù)合體。72 個(gè)F-box 家族成員根據(jù)底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特征被分為W、L和O 共3 個(gè)亞家族［4］。F-box 蛋白22（F-box only protein 22，F(xiàn)BXO22）作為O 亞家族的成員之一，其基因最早被發(fā)現(xiàn)是抑癌基因TP53 的靶基因［5］；同時(shí)，F(xiàn)BXO22 可與甲基化P53、去甲基化酶4A形成三元復(fù)合體以調(diào)控細(xì)胞衰老［6］。近年來(lái)圍繞FBXO22 在腫瘤中作用的研究表明：FBXO22 可通過(guò)降解類Krüppel 因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖［7］；通過(guò)調(diào)控不同底物，促進(jìn)乳腺癌的生長(zhǎng)或抑制其轉(zhuǎn)移［8-9］；通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）的活性，降解轉(zhuǎn)錄因子BACH1（BTB and CNC homology 1），抑制腎癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［10-11］；且本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO22 可 分 別 通 過(guò) 肝 激 酶B1 （liver kinase B1，LKB1）［12］、 抑 癌 蛋 白PTEN （phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）［13］促進(jìn)肺癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。綜上所述，F(xiàn)BXO22能夠在多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等作用，具有重要的臨床研究意義。

凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）是位于線粒體內(nèi)外膜間隙的一類黃素蛋白，可在烷化劑甲基硝基亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）損傷、氧化應(yīng)激下激活多聚ADP-核糖聚合酶PARP-1，導(dǎo)致多聚ADP-核糖PAR 累積，進(jìn)而促進(jìn)AIF從線粒體釋放入核，并引起染色質(zhì)凝集和DNA 大片段化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14-18］。

目前相關(guān)研究［19-20］顯示，E3 連接酶X 連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）僅能夠影響AIF的活性，不能調(diào)控AIF水平。基于此，本研究通過(guò)挖掘FBXO22 的新底物，探討其調(diào)控底物的分子作用機(jī)制，并研究該調(diào)控在結(jié)腸腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用，以期為腫瘤的臨床治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器

HEK293T 細(xì)胞，肺癌細(xì)胞株A549，結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、SW620，結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 以及前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），F(xiàn)bxo22 野生型（Fbxo22+/+）和敲除型（Fbxo22?/?）小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryo fibroblasts，MEF）（由本課題組前期構(gòu)建并保存）。FBXO22抗體（Proteintech Group，美國(guó)），AIF抗體（Abcam，美國(guó)），CUL1 抗體、SKP1 抗體、XIAP 抗體、β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠源或兔源免疫球蛋白抗體（CST，美國(guó)），血凝素（hemagglutinin，HA）標(biāo)簽抗體、偶聯(lián)Flag抗體的M2親和瓊脂糖珠（Sigma-Aldrich，美國(guó)），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），凋亡試劑盒（eBioscience，美國(guó)），Lipo2000（Invitrogen，美國(guó)），KOD DNA 聚合酶（Toyobo，日本），T4 連接酶（Promega，美國(guó)）。電泳儀、PCR 儀（Bio-Rad，美國(guó)），流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293T細(xì)胞、A549細(xì)胞、PC3細(xì)胞和MEF細(xì)胞使用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，SW480 細(xì)胞、SW620 細(xì)胞和HCT116 細(xì)胞使用含10%FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.3 表達(dá)型質(zhì)粒及短發(fā)卡RNA質(zhì)粒的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

表達(dá)型質(zhì)粒構(gòu)建：將擴(kuò)增的FBXO22 全長(zhǎng)和缺失Fbox 結(jié)構(gòu)域（ΔF）的編碼序列（coding sequence，CDS）分別插入PBABE-Flag 載體構(gòu)建帶標(biāo)簽的PBABE-Flag-FBXO22和PBABE-Flag-FBXO22-ΔF 表達(dá)質(zhì)粒，再將其二者分別插入PLVX-ZSGreen 載體構(gòu)建無(wú)標(biāo)簽的PLVXZSGreen-FBXO22 和PLVX-ZSGreen-FBXO22-ΔF 表 達(dá) 質(zhì)粒；將擴(kuò)增的AIF、CUL1 的全長(zhǎng)CDS 序列分別插入PBABE-Flag 載體，構(gòu)建帶標(biāo)簽的PBABE-Flag-AIF 和PBABE-Flag-CUL1 表達(dá)質(zhì)粒；將AIF 的全長(zhǎng)CDS 序列插入PCDNA3.0 載體，構(gòu)建PCDNA3.0-AIF 表達(dá)質(zhì)粒；將擴(kuò)增的ubiquitin的全長(zhǎng)CDS序列插入PCDNA3.0-HA 載體構(gòu)建PCDNA3.0-HA-ubiquitin 表達(dá)質(zhì)粒。未插入CDS 的PBABE-Flag 為 空 載 體（empty vector， EV）， 記 為PBABE-Flag-EV。

短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）質(zhì)粒構(gòu)建：分別將特異靶向FBXO22 或XIAP 的shRNA 片段與線性化pSIREN Retro-Q 載體連接，構(gòu)建沉默特定基因的敲除質(zhì)粒（具體步驟參照T4 連接酶說(shuō)明書）。特異靶向shRNA 片段的序列包括：shFBXO22#1，GTGTGGTCCTTGTCTTT GGTT；shFBXO22#2，CGCATCTTACCACATACAGTT；shFBXO22#3，CCCAAACAATGCCAAGTCCTT；shXIAP，AGATATCTGGGAGCAACTATA。同時(shí)，使用無(wú)靶向效應(yīng)的序列插入到pSIREN Retro-Q載體構(gòu)建陰性對(duì)照shNC。

向培養(yǎng)皿中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293T 細(xì)胞，待其生長(zhǎng)融合度達(dá)50%～60%時(shí)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，具體步驟參照Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析

分別向HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染帶標(biāo)簽的PBABE-Flag-EV（Control組）和PBABE-Flag-FBXO22表達(dá)質(zhì)粒（FBXO22組）24 h，收集HEK293T細(xì)胞并向其中加入1×RIPA細(xì)胞裂解液（含50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1%NP40、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、1×蛋白酶抑制劑的混合液）進(jìn)行裂解，而后于4 ℃、17 000×g離心10 min去除細(xì)胞碎片，獲得全細(xì)胞裂解液。將其與M2瓊脂糖珠孵育行免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）。隨后，使用PBST緩沖液［含0.1%吐溫的1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）］洗滌M2珠3次。收集M2珠，并向其中加入1×SDS裂解液，于100 ℃下變性分離免疫沉淀復(fù)合物與M2珠。最后，將獲得的免疫復(fù)合物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，使用考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行染色，掃描儀成像后送至質(zhì)譜平臺(tái)對(duì)上述2組的差異條帶進(jìn)行鑒定分析，尋找FBXO22的相互作用蛋白。以檢測(cè)到過(guò)表達(dá)組中FBXO22自身的肽段數(shù)目，及已知的與FBXO22相互作用蛋白SKP1、CUL1和RBX1的肽段數(shù)目作為判斷IP的成敗標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 變性條件下泛素化修飾實(shí)驗(yàn)

分 別 向HEK293T 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 染Flag-AIF、 FBXO22、FBXO22-ΔF 以及HA-ubiquitin 表達(dá)質(zhì)粒24 h 后，收取細(xì)胞沉淀。向其中加入適量1×SDS 裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，并于100 ℃進(jìn)行蛋白變性以去除蛋白與蛋白間的非特異性結(jié)合。經(jīng)17 000×g 離心10 min 去除不溶沉淀后，取上清液并向其中加入1×RIPA 細(xì)胞裂解液，以稀釋至SDS 終濃度為0.1% 后與M2 珠孵育行后續(xù)IP，檢測(cè)過(guò)表達(dá)FBXO22或FBXO22-ΔF對(duì)AIF泛素化水平的影響。

1.6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

向HEK293T 細(xì) 胞 轉(zhuǎn)染FBXO22 或FBXO22-ΔF 構(gòu)建FBXO22 過(guò)表達(dá)細(xì)胞株（PLVX-ZSGreen-FBXO22/ΔF 為實(shí)驗(yàn)組，PLVX-ZSGreen-EV 為對(duì)照組），分別向HEK293T細(xì)胞、MFE 細(xì)胞、SW620 細(xì)胞、HCT116 細(xì)胞和PC3 細(xì)胞 轉(zhuǎn) 染shFBXO22#1、shFBXO22#2、shFBXO22#3 構(gòu) 建FBXO22 敲 低 的 細(xì) 胞 株（shFBXO22#1、shFBXO22#2、shFBXO22#3 為實(shí)驗(yàn)組，shNC 為對(duì)照組），分別向A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染shFBXO22#1、shXIAP 構(gòu)建FBXO22、XIAP 敲低的細(xì)胞株（shFBXO22#1、shXIAP 為實(shí)驗(yàn)組，shNC 為對(duì)照組）。培養(yǎng)并收集上述構(gòu)建好的細(xì)胞，向其中加入1×SDS 裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，于100 ℃進(jìn)行蛋白變性，經(jīng)SDS-PAGE后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉1 h 后加入FBXO22 和AIF 抗體于4 ℃過(guò)夜。次日，經(jīng)PBS 洗滌后，向其中加入相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠源或兔源免疫球蛋白抗，室溫孵育1 h。洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲低FBXO22對(duì)AIF蛋白水平的影響。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

向SW480 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染shNC、shFBXO22#1 和shFBXO22#2 構(gòu)建FBXO22 敲低的細(xì)胞株（shFBXO22#1、shFBXO22#2 為實(shí)驗(yàn)組，shNC 為對(duì)照組）；分別向SW480、 SW620 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 染PLVX-ZSGreen-FBXO22 或PLVX-ZSGreen-EV，構(gòu)建FBXO22 過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株（其中PLVX-ZSGreen-FBXO22 為實(shí)驗(yàn)組、PLVX-ZSGreen-EV為對(duì)照組）。將構(gòu)建完成的SW480 細(xì)胞或SW620 細(xì)胞分別按照2×105個(gè)或5×105個(gè)接種于12 孔板中，培養(yǎng)24 h 后加入500 μmol/L MNNG 處理15 min，而后換正常的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h（記為MNNG 處理組）；或加入1 mmol/L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)12 h（記為H2O2處理組）；或加入PBS后同MNNG、H2O2步驟處理（記為PBS組）。待觀察到處理組細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡時(shí)收集所有細(xì)胞，于2 000×g離心5 min 收集細(xì)胞沉淀，按照凋亡試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)記處理， 制備好待測(cè)樣品后于0.5 h 內(nèi)使用BD LSRFortessa流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)與分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以±s 表示，組間兩兩比較使用Student's t 檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FBXO22相互作用蛋白的鑒定

本研究采用IP 聯(lián)合質(zhì)譜分析技術(shù)尋找與FBXO22 相互作用的蛋白，結(jié)果（圖1）顯示免疫沉淀復(fù)合物中Flag-FBXO22 被明顯富集。將Control 組和FBXO22 組進(jìn)一步行質(zhì)譜鑒定分析差異蛋白，結(jié)果（表1）顯示過(guò)表達(dá)組中檢測(cè)到的與FBXO22 相互作用的SKP1、CUL1 及RBX1 蛋白（已報(bào)道的）匹配的肽段數(shù)分別為327、76 和11個(gè)，對(duì)照組中均為0，提示IP成功；過(guò)表達(dá)組檢測(cè)到的AIF的肽段數(shù)為9，對(duì)照組為0，提示FBXO22與AIF存在特異性結(jié)合。

圖1 SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)2組免疫沉淀復(fù)合物Fig 1 Immunoprecipitation complexes of the two groups detected by SDS-PAGE and Coomassie bright blue staining

表1 質(zhì)譜鑒定2組差異蛋白的肽段數(shù)Tab 1 Different protein peptide number of the two groups detected by IP/MS technology

2.2 IP 檢測(cè)FBXO22 與AIF 的相互作用及其 對(duì)AIF 泛素化水平的影響

本研究向HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒24 h 后，收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行IP，結(jié)果（圖2A）顯示Flag-FBXO22 與內(nèi)源性AIF 存在相互作用。共表達(dá)Flag-AIF 與FBXO22/FBXO22-ΔF 的雙外源IP 實(shí)驗(yàn)（圖2B、2C）顯示，F(xiàn)lag-AIF 與FBXO22、FBXO22-ΔF 均存在相互作用，提示AIF與FBXO22 存在相互作用且該作用不依賴FBXO22 的Fbox 結(jié)構(gòu)域。隨后，為驗(yàn)證AIF 是否通過(guò)FBXO22 與SCF復(fù)合體連接，在HEK293T 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PBABE-Flag-CUL1/PBABE-Flag-EV、 PCDNA3.0-AIF 及 PLVXZSGreen-FBXO22進(jìn)行IP，結(jié)果（圖2D）顯示Flag-CUL1成功沉淀SKP1、FBXO22 的同時(shí)也將AIF 沉淀下來(lái)，證明AIF通過(guò)FBXO22與SCF復(fù)合體相結(jié)合。

本研究通過(guò)變性條件泛素化IP 實(shí)驗(yàn)分析AIF 的泛素化水平，結(jié)果（圖2E）顯示過(guò)表達(dá)FBXO22 可顯著增強(qiáng)AIF 的泛素化修飾水平，而過(guò)表達(dá)FBXO22-ΔF 對(duì)AIF 的泛素化修飾水平?jīng)]有明顯影響。

圖2 IP檢測(cè)FBXO22與AIF的相互作用及其對(duì)AIF泛素化水平的影響Fig 2 IP detection of the interaction between FBXO22 and AIF and its effect on the ubiquitination level of AIF

2.3 FBXO22對(duì)AIF蛋白表達(dá)水平的影響

采用蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測(cè)HEK293T細(xì)胞中敲低FBXO22 對(duì)AIF 蛋白水平的影響，結(jié)果（圖3A）顯示與shNC 組相比，shFBXO22#1、shFBXO22#2、shFBXO22#3 組的AIF 水平有明顯增加。反之，本研究在HEK293T 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)FBXO22 及FBXO22-ΔF 質(zhì)粒，結(jié)果（圖3B）顯示，與PLVX-ZSGreen-EV 組相比，過(guò)表達(dá)FBXO22 可顯著下調(diào)AIF 水平，而過(guò)表達(dá)FBXO22-ΔF卻沒(méi)有此作用。

此外，通過(guò)Western blotting 檢測(cè)Fbxo22+/+和Fbxo22?/?型MEF細(xì)胞中AIF水平，結(jié)果（圖3C）顯示Fbxo22缺失可顯著上調(diào)AIF的表達(dá)水平。通過(guò)Western blotting檢測(cè)敲低FBXO22或XIAP對(duì)A549細(xì)胞中AIF水平的影響，結(jié)果（圖3D）顯示敲低FBXO22可顯著上調(diào)AIF 水平，但敲低XIAP對(duì)AIF水平無(wú)較大影響。隨后的結(jié)果（圖3E～G）顯示在SW620 細(xì)胞、HCT116 細(xì)胞以及PC3 細(xì)胞中敲低FBXO22 均可顯著上調(diào)AIF 水平。以上結(jié)果均表明，F(xiàn)BXO22可負(fù)調(diào)控AIF的表達(dá)水平。

圖3 Western blotting檢測(cè)FBXO22對(duì)AIF水平的影響Fig 3 Effect of FBXO22 on AIF level by Western blotting

2.4 FBXO22對(duì)AIF介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡水平的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：①SW480 細(xì)胞（FBXO22 敲低細(xì)胞株） 經(jīng)MNNG、H2O2處理后，結(jié)果顯示，與shNC 組相比，shFBXO22#1 實(shí)驗(yàn)組和shFBXO22#2 實(shí)驗(yàn)組中凋亡細(xì)胞的占比均較高（圖4A）。②經(jīng)MNNG 誘導(dǎo)的SW620 細(xì)胞（FBXO22 過(guò)表達(dá)細(xì)胞株）中，PLVX-ZSGreen-FBXO22 實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞比例較PLVX-ZSGreen-EV 組有明顯減少（圖4B）；且在經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的SW480 細(xì)胞（FBXO22 過(guò)表達(dá)細(xì)胞株）中，PLVX-ZSGreen-FBXO22 實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞比例較PLVX-ZSGreen-EV 組亦有明顯減少（圖4C）。上述結(jié)果均表明，F(xiàn)BXO22可抑制由AIF介導(dǎo)的結(jié)腸腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖4 FBXO22對(duì)AIF介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡的影響Fig 4 Effect of FBXO22 on cancer cell apoptosis mediated by AIF

3 討論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO22 可分別通過(guò)LKB1［12］和PTEN［13］促進(jìn)肺癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖；且越來(lái)越多的研究［7-11］表明FBXO22 在多種腫瘤中表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的雙重作用，具有重要的臨床研究意義。本研究利用免疫沉淀技術(shù)挖掘FBXO22 的相互作用蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定顯示在其相互作用表達(dá)譜中存在AIF；隨后通過(guò)體外轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)BXO22與AIF存在相互作用。目前，關(guān)于AIF 表達(dá)調(diào)控的研究十分有限。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，凋亡相關(guān)因子酸性亮氨酸核磷酸蛋白32B［21］和CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白［22］僅調(diào)控AIF 的轉(zhuǎn)錄水平。有報(bào)道顯示，P53 可在不依賴DNA 損傷應(yīng)激的情況下促進(jìn)AIF 轉(zhuǎn)錄［23］。在蛋白水平上，僅發(fā)現(xiàn)XIAP 能泛素化AIF但不能降解AIF，即僅影響AIF的酶活性［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)FBXO22可調(diào)控AIF的泛素化水平，即敲低FBXO22可使AIF 水平上調(diào)、過(guò)表達(dá)FBXO22可使AIF水平下調(diào)；因此，F(xiàn)BXO22 是目前首個(gè)可以在蛋白水平上調(diào)控AIF 的E3連接酶。

AIF在烷化劑損傷、氧化應(yīng)激等刺激下可引起染色體凝集和DNA 大片段化，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17-18］。研究［14-16］顯示，MNNG 是一種被公認(rèn)的可通過(guò)AIF 誘發(fā)細(xì)胞凋亡的烷化劑。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低FBXO22 可上調(diào)AIF 的水平，進(jìn)而增加在MNNG 誘導(dǎo)下結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡比例；反之，過(guò)表達(dá)FBXO22 則可下調(diào)AIF 水平，減少在MNNG 誘導(dǎo)下的凋亡比例；繼而提示，F(xiàn)BXO22 可抑制由AIF 介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，具有促腫瘤效應(yīng)，與現(xiàn)有報(bào)道一致。

除了能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡外，AIF 還能與CHCHD4（coiled-coil-helix-coiled-coil-helix-domain-containing protein 4）結(jié)合共同調(diào)節(jié)線粒體的氧化呼吸鏈，維持其正常功能，為細(xì)胞存活提供能量保障［24-26］。另有研究［27］發(fā)現(xiàn)，AIF 可以維持PTEN 的脂質(zhì)磷酸酶的活性，抑制蛋白激酶B 活化，進(jìn)而抑制β-catenin 信號(hào)通路，阻止上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。然而，F(xiàn)BXO22 是否能通過(guò)調(diào)控AIF的蛋白水平對(duì)AIF介導(dǎo)的線粒體氧化呼吸功能和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步探討。

參·考·文·獻(xiàn)

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