酶消化細(xì)胞團(tuán)塊法對(duì)人胚胎干細(xì)胞中OCT4 與SOX2 蛋白水平的影響

孫瀟智，李 爽，金 穎，廖 兵

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎與遺傳發(fā)育學(xué)系，上海200025

人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，hESC）是胚胎著床前的多能細(xì)胞在體外培養(yǎng)中形成的多能干細(xì)胞系，其具有兩大特性——無(wú)限自我更新和多能性。無(wú)限自我更新是指在體外適宜培養(yǎng)條件下，hESC 能夠無(wú)限增殖并保持未分化狀態(tài)；多能性則是指hESC 能夠分化成為體內(nèi)所有類型細(xì)胞的發(fā)育潛能。以上兩大特性使得hESC 在藥物研發(fā)與再生醫(yī)學(xué)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。為了滿足臨床應(yīng)用的要求，在體外培養(yǎng)中獲得狀態(tài)更好、更均質(zhì)的hESC 就成為亟需解決的關(guān)鍵性問(wèn)題，而對(duì)維持hESC 自我更新的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究有助于該問(wèn)題的解決。隨著相關(guān)研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)維持hESC 的自我更新不僅需要重要的細(xì)胞因子，例如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 等［1-4］，還 需 要 維 持 細(xì) 胞 與 細(xì) 胞 外 基 質(zhì)（extracellular matrix，ECM） 之間（hESC-ECM），以及細(xì)胞與細(xì)胞之間（hESC-hESC）的相互作用。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為hESC 通過(guò)整合素（integrin）黏附于ECM，不同類型的整合素能夠與不同類型的ECM 組分結(jié)合［5］。而且，已有研究［6-9］表明ECM 的軟硬度影響hESC 的自我更新和向不同細(xì)胞譜系的分化。但是，對(duì)于ECM 與hESC 相互作用如何調(diào)控自我更新與多能性相關(guān)信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的研究還相對(duì)匱乏。

目前，已有研究［10-11］證實(shí)，八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding protein 4，OCT4）和性別決定區(qū)Y 框蛋白2（sex determining region Y-box 2，SOX2）在hESC 自我更新維持與分化過(guò)程中發(fā)揮決定性作用，其蛋白水平的高低直接影響hESC 細(xì)胞的命運(yùn)。有研究［12］發(fā)現(xiàn)，在hESC 中過(guò)表達(dá)OCT4 可上調(diào)內(nèi)胚層分化的標(biāo)志性基因表達(dá)，而減少OCT4的表達(dá)水平可促進(jìn)中胚層和內(nèi)胚層分化的標(biāo)志性基因表達(dá)；另有研究［13］表明，在hESC 中降低OCT4水平可促進(jìn)滋養(yǎng)外胚層分化的標(biāo)志性基因表達(dá)。此外，升高或降低SOX2 表達(dá)水平均可誘導(dǎo)hESC 向滋養(yǎng)外胚層分化［14］。但是，hESC 與ECM 相互作用對(duì)核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4 與SOX2 蛋白水平的影響還不清楚。本研究報(bào)道了破壞hESC 與ECM 相互作用對(duì)OCT4 和SOX2 蛋白質(zhì)水平的負(fù)調(diào)控作用，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)來(lái)源的人胚胎干細(xì)胞系SHhES8，由本實(shí)驗(yàn)室建立［15］。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基、α-微管蛋白（α-tubulin） 抗體（貨號(hào)T5168）、羅丹明-鬼筆環(huán)肽（rhodamine phalloidin）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，F(xiàn)12 培養(yǎng)基、胰蛋白酶和膠原酶Ⅳ（collagenase type Ⅳ，COL4）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，mTeSR1 培養(yǎng)基、細(xì)胞分離溶液Accutase 和分散酶Dispase 購(gòu)自美國(guó)Stemcell Technologies公司，Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning 公司，乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）購(gòu)自上海碧云天公司，乙二胺四乙酸（EDTA）、熒光二抗（AlexaFluor-488/555/647）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，20S 蛋白酶體抑制劑bortezomib、Rac1 抑制劑EHT 1864 和EHop-016購(gòu)自美國(guó)Selleck 公司，氯喹購(gòu)自上海Topscience 公司，SOX2 抗體（貨號(hào)AF2018）購(gòu)自美國(guó)R&D 公司，OCT4抗體（貨號(hào)sc-2079）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，絲切蛋白（cofilin）抗體（貨號(hào)5175）、p-cofilin Ser3 抗體（貨號(hào)3313）、LIM domain kinase 2（LIMK2）抗體（貨號(hào)3845）、p-LIMK1 Thr508/p-LIMK2 Thr505 抗體（貨號(hào)3841）、integrin-β1 抗體（貨號(hào)9699）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（貨號(hào)4967）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號(hào)5174）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERAcell 150i，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），倒置生物顯微鏡（ECLIPSETi-S，日本Nikon 公司），全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（5200S，上海Tanon 公司），激光共聚焦顯微鏡（TCS SP8，德國(guó)Leica 公司），軌道阱質(zhì)譜儀（LTQ Orbitrap Velos，美國(guó)Thermo Finnigan公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 hESC 的培養(yǎng)及不同傳代處理方式的比較 復(fù)蘇SHhES8 細(xì)胞株，接種于Matrigel 包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入mTeSR1 細(xì)胞培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37 ℃，5%CO2），每日更換新鮮mTeSR1 細(xì)胞培養(yǎng)液。待細(xì)胞克隆長(zhǎng)到合適大小，采用不同細(xì)胞傳代方式進(jìn)行處理。加入適量Dispase（1 mg/mL）或COL4（1 mg/mL）消化約8 min，使用DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)吹打細(xì)胞集落成為懸浮的細(xì)胞團(tuán)塊。利用Accutase（約7 min）或0.05%胰蛋白酶（約3 min） 在37 ℃分別消化hESC，使用DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)吹打細(xì)胞集落成為懸浮的單細(xì)胞。同時(shí)以機(jī)械法（用細(xì)胞刮板刮取細(xì)胞，Scrape）和未做處理的細(xì)胞（Ctrl）作為對(duì)照。離心收集細(xì)胞（100×g，5 min），加入1×蛋白上樣緩沖液［protein loading buffer（PLB），含50 mmol/L Tris-Cl（pH 7.4）、2%SDS、5%β-巰基乙醇、10%甘油、0.01%溴酚藍(lán)］裂解細(xì)胞，于100 ℃條件下熱變性5 min，超聲處理30 s。收集的細(xì)胞蛋白樣品用于Western blotting分析OCT4和SOX2的蛋白水平。

1.2.2 細(xì)胞分組 為進(jìn)一步探究hESC-ECM、hESChESC 的相互作用對(duì)細(xì)胞OCT4 和SOX2 蛋白表達(dá)的影響，將hESC 分 為COL4 組、EGTA 組、COL4+EGTA 組、Scrape 組、EDTA 組和對(duì)照組（Ctrl 組）。EGTA 是特異性鈣離子螯合劑，可用于破壞hESC-hESC 的相互作用。EGTA 組細(xì)胞加入1 mmol/L EGTA（37 ℃，4 min），使用DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)吹打細(xì)胞集落成為懸浮的單細(xì)胞。COL4+EGTA 組細(xì)胞經(jīng)COL4 處理（同COL4 組）后，使用1×PBS 洗滌1 次，然后加入EGTA 處理（同EGTA 組）后，吹打?yàn)閼腋〉膯渭?xì)胞。EDTA 作為金屬離子螯合劑，能夠同時(shí)破壞hESC-ECM 和hESC-hESC 的相互作用，將hESC 克隆消化為單細(xì)胞。EDTA 組細(xì)胞加入1 mmol/L EDTA（37 ℃，1 min），吹打細(xì)胞集落成為懸浮的單細(xì)胞。收集細(xì)胞蛋白樣品用于Western blotting分析。

1.2.3 Western blotting 分析 取適量蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳，然后采用濕式電轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加入3%牛血清白蛋白封閉（室溫，1 h），一抗（1∶1 000～1∶500 稀釋）4 ℃下孵育過(guò)夜，1×TBS-T 洗滌3 次，加入HRP 偶聯(lián)二抗，室溫孵育2 h，1×TBS-T 洗滌3 次，通過(guò)電化學(xué)發(fā)光試劑（electrochemiluminescence，ECL）進(jìn)行目的條帶顯色，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)采集圖像。利用軟件Image J［16］的plot lane 和wand tool功能測(cè)量蛋白信號(hào)條帶的灰度值。

1.2.4 蛋白質(zhì)譜分析 收集Ctrl 組、COL4 組和COL4+EGTA 組的蛋白樣品（hESC 裂解于1×PLB），交由杭州景杰生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。簡(jiǎn)要檢測(cè)步驟如下：蛋白樣品經(jīng)過(guò)定量、質(zhì)檢與淬煉等處理后，使用LTQ Orbitrap Velos 質(zhì)譜儀檢測(cè)磷酸化修飾蛋白與總蛋白，并用軟件MaxQuant （version 1.2.2.5）進(jìn)行分析定量。然后利用網(wǎng)絡(luò)在線分析軟件Metascope（http：//metascape.org/）對(duì)各組間差異表達(dá)的磷酸化蛋白和總蛋白（蛋白表達(dá)差異倍數(shù)>1.2）進(jìn)行功能富集分析。

1.2.5 免疫熒光染色 使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，1%Triton X-100透膜2 min，加入含6%驢血清的封閉液與細(xì)胞樣品室溫孵育1 h，按照1∶500～1∶250 比例稀釋一抗，并與細(xì)胞樣品4 ℃孵育過(guò)夜。1×PBS 洗滌3次，按照1∶500 比例稀釋熒光二抗，將細(xì)胞樣品與二抗在暗盒中室溫孵育2 h，然后用熒光染料DAPI 復(fù)染來(lái)標(biāo)記細(xì)胞核（室溫、暗盒，孵育15 min），1×PBS 洗滌3 次，封片后，使用激光共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)采集圖像。利用軟件Image J［16］的threshold 和measurement 功能測(cè)量免疫熒光信號(hào)強(qiáng)度的平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料均符合正態(tài)分布和方差齊性，用±s表示，利用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行組間比較，利用Turkey多重比較法進(jìn)行兩兩比較。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)過(guò)3次以上獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。若P<0.05，則認(rèn)為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞傳代方法對(duì)OCT4和SOX2蛋白量的影響

在hESC傳代過(guò)程中，酶消化法和機(jī)械法是比較常用的實(shí)驗(yàn)手段。常用的酶包括COL4、Dispase、Accutase和胰酶等，其中COL4和Dispase能破壞hESC-ECM的相互作用，但不影響hESC-hESC的相互作用，可以將hESC集落消化為細(xì)胞團(tuán)塊；而Accutase和胰酶能同時(shí)破壞hESC-ECM和hESChESC的相互作用，將hESC集落消化成單細(xì)胞。與未處理細(xì)胞（Ctrl）相比，使用COL4或Dispase處理導(dǎo)致hESC中OCT4與SOX2蛋白水平在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生顯著下降，而使用Accutase或胰酶以及機(jī)械法（Scrape）均對(duì)OCT4與SOX2的蛋白水平?jīng)]有顯著影響（圖1）。

2.2 EGTA對(duì)COL4處理引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降的抑制作用

用COL4 或Dispase 將hESC 消化成細(xì)胞團(tuán)塊導(dǎo)致OCT4 和SOX2 蛋白水平下降，而消化成單細(xì)胞不影響其蛋白水平，提示這2 種蛋白水平下降可能與單獨(dú)破壞hESC-ECM 的相互作用有關(guān)。為了驗(yàn)證該假設(shè)，我們采用分別破壞hESC-ECM 和hESC-hESC 細(xì)胞間相互作用的實(shí)驗(yàn)策略，即利用COL4 破壞hESC-ECM 相互作用［17］，利用EGTA 破壞hESC-hESC 細(xì)胞間相互作用［18］，研究這2 種相互作用對(duì)OCT4 與SOX2 蛋白量的影響。Western blotting 結(jié)果（圖2）顯示，與EDTA 組以及Scrape 組相似，EGTA 對(duì)OCT4 和SOX2 蛋白水平?jīng)]有明顯影響，但是EGTA 聯(lián)合處理可以阻止COL4 導(dǎo)致的OCT4 和SOX2蛋白水平下降。

圖1 Western blotting 分析不同細(xì)胞傳代方法對(duì)hESC 中OCT4 和SOX2 蛋白水平的影響Fig 1 Effects of different cell passage methods on protein levels of OCT4 and SOX2 in hESCs detected by Western blotting

2.3 蛋白質(zhì)譜分析篩選差異表達(dá)蛋白

由于破壞hESC-ECM的相互作用在短時(shí)間內(nèi)即導(dǎo)致OCT4與SOX2蛋白水平的下降，推測(cè)蛋白磷酸化信號(hào)通路可能參與該過(guò)程的調(diào)控。我們采用定量蛋白質(zhì)譜分析，鑒定Ctrl組、COL4組和COL4+EGTA組中差異表達(dá)的磷酸化修飾蛋白和總蛋白，并進(jìn)行功能富集分析。分析結(jié)果顯示，COL4組與Ctrl組的差異表達(dá)磷酸化蛋白功能注釋分析富集到多個(gè)對(duì)干細(xì)胞非常重要的基礎(chǔ)生命過(guò)程，如mRNA加工與細(xì)胞周期等，也富集到與肌動(dòng)蛋白微絲（actin filament，F(xiàn)-actin）、微管相關(guān)的功能條目（圖3A）。

圖2 同時(shí)或分別破壞hESC-ECM和hESC-hESC的相互作用對(duì)OCT4和SOX2蛋白水平的影響Fig 2 Effect of disruption of hESC-hESC and hESC-ECM interactions simultaneously or respectively on the protein levels of OCT4 and SOX2 in hESCs

在總蛋白水平，與Ctrl 組相比，COL4 組的自噬相關(guān)蛋白水平上調(diào)（圖3B），COL4+EGTA 組的溶酶體相關(guān)蛋白的水平下調(diào)（圖3C）。以Ctrl 組為基準(zhǔn)，在COL4 組中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有34 個(gè)，在COL4+EGTA 組表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)有1 165 個(gè)，兩者交集發(fā)現(xiàn)7 個(gè)共有蛋白質(zhì)，其中GNAI3 （G protein subunit alpha I3） 和ATP6V0C（ATPase H+transporting V0 subunit C）均與溶酶體活性相關(guān)（圖3D）。該結(jié)果提示破壞hESC-ECM 相互作用下調(diào)OCT4與SOX2蛋白水平可能有溶酶體的參與。

2.4 抑制溶酶體活性對(duì)COL4 引起的OCT4 和SOX2 蛋白水平下降的影響

為了判斷破壞hESC-ECM的相互作用是否通過(guò)溶酶體下調(diào)OCT4與SOX2蛋白水平，我們使用溶酶體抑制劑氯喹（100 μmol/L）預(yù)處理2 h觀察對(duì)這2個(gè)蛋白水平的影響，同時(shí)使用20S蛋白酶體抑制劑bortezomib（100 μmol/L，預(yù)處理2 h）作為對(duì)照。Western blotting結(jié)果顯示，bortezomib不能阻斷COL4處理引起的OCT4和SOX2蛋白水平的下降（圖4A），但是氯喹有效地抑制了OCT4和SOX2的蛋白水平下調(diào)（圖4B）。另外，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)也顯示氯喹能夠挽救COL4處理導(dǎo)致的SOX2蛋白水平下降（圖4C）。

2.5 Rac1/cofilin/F-actin 信號(hào)通路在COL4 引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降中的作用

蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，COL4處理后，差異磷酸化蛋白富集到F-actin 和微管蛋白相關(guān)的功能條目，提示細(xì)胞骨架系統(tǒng)可能介導(dǎo)hESC-ECM 相互作用對(duì)OCT4 與SOX2 蛋白穩(wěn)態(tài)的維持。激光共聚焦顯微鏡分層掃描結(jié)果（圖5A）顯示，羅丹明-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的F-actin 在貼壁生長(zhǎng)的hESC 中呈現(xiàn)極性分布，主要位于基底側(cè)（basal side）和細(xì)胞-細(xì)胞連接區(qū)域（lateral side），而在細(xì)胞頂端（apical side）分布很少，提示F-actin與hESC-ECM 相互作用的相關(guān)性。作為對(duì)照，α-tubulin 在hESC 中無(wú)明顯極性分布。而SOX2蛋白主要定位在細(xì)胞核中。

圖3 蛋白質(zhì)譜分析鑒定的差異表達(dá)磷酸化蛋白和總蛋白的功能富集Fig 3 Functional enrichment on differentially expressed phosphorylated proteins and total proteins identified by proteomics analysis

圖4 氯喹對(duì)COL4引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降的影響Fig 4 Effect of chloroquine on the decrease of OCT4 and SOX2 protein levels induced by COL4

有研究表明Rac1/cofilin信號(hào)通路可調(diào)控F-actin的形態(tài)結(jié)構(gòu)［19］。因此，我們檢測(cè)了該信號(hào)通路中關(guān)鍵因子cofilin的表達(dá)。在COL4組中，p-cofilin與cofilin蛋白水平下降顯著，而integrin-β1的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化（圖5B）。而且，應(yīng)用Rac1小分子抑制劑EHT1864或EHop016處理hESC均可導(dǎo)致p-cofilin、cofilin、p-LIMK1/2、LIMK2與SOX2蛋白水平下降（圖5C）。

圖5 Rac1/cofilin/F-actin信號(hào)通路在COL4引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降中的作用Fig 5 Role of Rac1/cofilin/F-actin signaling pathway in the COL4-induced decrease of OCT4 and SOX2 protein levels

3 討論

有研究報(bào)道hESC-ECM［20］和hESC-hESC［18］連接參與調(diào)控hESC 自我更新的維持，但是兩者與hESC 中核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4 和SOX2 的聯(lián)系還未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，我們首先發(fā)現(xiàn)使用COL4或Dispase消化hESC集落成為細(xì)胞團(tuán)塊時(shí)，OCT4 與SOX2 蛋白水平迅速下降，然而使用Accutase 或胰酶消化hESC 集落成為單細(xì)胞時(shí)，不影響OCT4 與SOX2 的蛋白水平。該發(fā)現(xiàn)提示打斷hESChESC 連接能夠阻止破壞hESC-ECM 相互作用所導(dǎo)致的OCT4 與SOX2 蛋白水平的下降。因?yàn)镋GTA 是特異的鈣離子螯合劑，常被用于破壞細(xì)胞間相互作用［18］，所以我們使用其破壞hESC-hESC 連接。與上述假設(shè)相一致，EGTA 能 夠 阻 止COL4 消 化hESC-ECM 引 起 的OCT4 與SOX2蛋白水平的下降，但是其中的確切分子機(jī)制尚不明確。進(jìn)一步研究顯示，當(dāng)使用COL4 消化法破壞hESCECM 相互作用時(shí)，可能有溶酶體和Rac1/cofilin/F-actin 信號(hào)通路的參與。

3.1 hESC-ECM 相互作用可能通過(guò)Rac1/cofilin/F-actin信號(hào)通路維持hESC中OCT4與SOX2的蛋白水平

通過(guò)蛋白質(zhì)譜分析，我們注意到F-actin 和溶酶體可能與OCT4、SOX2 蛋白水平下降有關(guān)。而且，F(xiàn)-actin 在hESC 的基底側(cè)呈極性分布，提示hESC-ECM 相互作用可能與F-actin 細(xì)胞骨架系統(tǒng)有聯(lián)系。此外，破壞hESCECM 相互作用導(dǎo)致Rac1/cofilin/F-actin 信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子cofilin 的蛋白水平下降，而且抑制Rac1 活性也能導(dǎo)致SOX2 蛋白水平顯著下降，所以Rac1/cofilin/F-actin信號(hào)通路可能參與了hESC-ECM 相互作用對(duì)OCT4 和SOX2蛋白水平的正向調(diào)控。有趣的是，溶酶體抑制劑氯喹能夠補(bǔ)救hESC-ECM 解離導(dǎo)致的OCT4 和SOX2 蛋白水平下降，我們猜測(cè)Rac1/cofilin/F-actin 信號(hào)通路可能通過(guò)抑制溶酶體途徑提升OCT4 和SOX2 的蛋白水平。由此可見(jiàn)，hESC 與ECM 相互作用可在一定程度上調(diào)控核心轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，該調(diào)控過(guò)程可能與Rac1/cofilin/F-actin 信號(hào)通路及溶酶體有關(guān)；但是兩者在該路徑中的確切作用以及具體的分子機(jī)制還需要更加深入的研究工作。

3.2 從蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持角度優(yōu)化hESC 酶消化細(xì)胞團(tuán)塊傳代方法

在進(jìn)行單層貼壁培養(yǎng)hESC 的細(xì)胞傳代時(shí)，細(xì)胞團(tuán)塊法和單細(xì)胞法是最常用的2 種方法。與單細(xì)胞法相比較，團(tuán)塊法傳代具有諸多優(yōu)點(diǎn)：不破壞細(xì)胞間連接，不易引起hESC 細(xì)胞凋亡，而且細(xì)胞貼壁性更好，自發(fā)分化細(xì)胞更少等。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，使用COL4 或Dispase 進(jìn)行酶消化細(xì)胞團(tuán)塊法傳代時(shí)，OCT4 與SOX2 的蛋白水平快速降低，而單細(xì)胞消化方法不影響OCT4 與SOX2 的蛋白水平。所以，細(xì)胞團(tuán)塊法傳代具有影響OCT4 和SOX2 蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的缺點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)EGTA 聯(lián)合COL4 處理能夠阻止OCT4、SOX2 以及F-actin 細(xì)胞骨架調(diào)控系統(tǒng)中關(guān)鍵蛋白cofilin 的蛋白水平下調(diào)。從維持hESC 傳代過(guò)程的蛋白穩(wěn)態(tài)的角度，我們的發(fā)現(xiàn)可能為優(yōu)化hESC 酶消化細(xì)胞團(tuán)塊傳代方法提供線索。但是，EGTA 聯(lián)合COL4 處理對(duì)hESC干性維持與分化的影響還有待進(jìn)一步的研究探索。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)酶消化細(xì)胞團(tuán)塊法會(huì)干擾hESC 的蛋白穩(wěn)態(tài)，特別是核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4 和SOX2 蛋白水平的下降，這可能損害hESC 的自我更新能力與多能性；引起該現(xiàn)象的原因可能是hESC-ECM 解離導(dǎo)致Rac1/cofilin/F-actin 信號(hào)通路活性下降以及溶酶體活性上升。而采用COL4 聯(lián)合EGTA 消化hESC 或利用溶酶體抑制劑均成功避免了團(tuán)塊消化法導(dǎo)致的OCT4 和SOX2蛋白水平下降，EGTA 的阻斷作用可能不僅與其對(duì)hESChESC 的解離作用有關(guān)，可能還與其能夠激活hESC 的Rac1/cofilin/F-actin 信號(hào)通路［18］有關(guān)。但是，hESC-ECM相互作用、Rac1/cofilin/F-actin 信號(hào)通路、溶酶體與OCT4、SOX2 蛋白穩(wěn)態(tài)的關(guān)系還未闡明，利用針對(duì)相關(guān)節(jié)點(diǎn)關(guān)鍵基因的基因編輯和化學(xué)小分子處理方法將有助于該問(wèn)題的回答。

參·考·文·獻(xiàn)

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