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    羅非魚皮蛋白多肽-Fe2+結(jié)合物的制備及性質(zhì)分析

    2021-05-19 07:05:32林善婷李來好楊賢慶陳勝軍吳燕燕
    食品科學(xué) 2021年8期
    關(guān)鍵詞:肽鏈解物羅非魚

    林善婷,胡 曉,李來好,楊賢慶,陳勝軍,吳燕燕,黃 卉,榮 輝

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院,江蘇 無錫 214081;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)研究室,廣東 廣州 510300)

    羅非魚(Oreochromis niloticus)因其具有生長快、病害少、肉質(zhì)鮮美、蛋白質(zhì)含量高等特點(diǎn),是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向世界各國推廣的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一。我國羅非魚資源豐富,其養(yǎng)殖產(chǎn)量和出口量穩(wěn)居世界前列[1]。然而,羅非魚加工產(chǎn)品主要以凍全魚和冷凍魚片為主,產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一,精深加工水平及高值化利用率不高,且羅非魚加工過程中會(huì)產(chǎn)生約60%~70%的富含蛋白質(zhì)的加工副產(chǎn)物,如魚皮、魚鱗、魚頭、魚骨、魚肉碎屑等,其加工副產(chǎn)物大多用作飼料、肥料或直接廢棄,其優(yōu)質(zhì)的蛋白資源未得到充分開發(fā)與利用[2]。

    鐵元素是人體中血紅素及大多數(shù)酶類的構(gòu)成成分,參與氧氣的運(yùn)輸及機(jī)體細(xì)胞代謝,在維持人體正常造血功能以及增強(qiáng)神經(jīng)/免疫系統(tǒng)功能中起重要作用,當(dāng)體內(nèi)缺乏鐵元素時(shí)易導(dǎo)致貧血、食欲不振、生長緩慢,尤其是孕期鐵元素缺乏的孕婦易導(dǎo)致胎兒早產(chǎn),增加母嬰死亡風(fēng)險(xiǎn)等[3]。鐵元素缺乏是世界上最常見且普遍的營養(yǎng)缺乏癥,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),在全球范圍內(nèi),幾乎一半的6~59 個(gè)月的兒童以及1/3的育齡婦女患有缺鐵性貧血癥[4]。

    Fe2+結(jié)合活性肽是指具有結(jié)合Fe2+活性的肽類物質(zhì),其與Fe2+結(jié)合后形成的肽-Fe2+結(jié)合物,在腸道中可提高并保持Fe2+的溶解度,提高Fe2+在腸道中的生物利用度[5]。目前,已有研究證明鷹嘴豆[6]、核桃[7]、綠豆[8]以及蛋清[9]、酪蛋白[10]、鱈魚皮[11-13]、鳀魚肌肉[14]等蛋白酶解物多肽具有Fe2+結(jié)合活性,而對于羅非魚皮酶解物多肽(tilapia skin protein peptides,TSPP)的Fe2+結(jié)合活性研究尚少。因此,本研究以羅非魚加工副產(chǎn)物之一的羅非魚皮為原料,制備Fe2+結(jié)合活性肽及其肽-Fe2+結(jié)合物,并探究其結(jié)合過程中結(jié)構(gòu)和活性的變化,為進(jìn)一步制備膳食鐵元素補(bǔ)充劑打下基礎(chǔ),也可提高羅非魚加工副產(chǎn)物的高值化利用率,提高我國羅非魚產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益以及在國際市場上的競爭力。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    羅非魚皮 廣東百維生物科技有限公司;胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、酪蛋白 合肥博美生物科技有限公司;菲啰嗪 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無水硫酸亞鐵(FeSO4)、乙酸鈉(CH3COONa)、冰醋酸(CH3COOH)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)(均為分析純) 上海麥克林生化科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、溴化鉀(KBr)(色譜級) 美國Sigma公司;ABTS總抗氧化能力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

    1.2 儀器與設(shè)備

    凱氏定氮儀 丹麥福斯分析儀器公司;水浴恒溫振蕩器 金壇市精達(dá)儀器制造廠;自動(dòng)電位滴定儀 瑞士萬通公司;SUNRISE吸光酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司;熒光分光光度計(jì) 美國VARIAN公司;紫外-可見分光光度計(jì)、紅外光譜儀、高效液相色譜儀 日本島津公司。

    1.3 方法

    1.3.1 TSPP的制備

    魚皮解凍洗凈,參照Zhang Yufeng等[15]的方法并稍作修改,按1∶10(g/mL)的比例加入0.05 mol/L的NaOH溶液,室溫下攪拌浸泡30 min后流水洗至中性,隨后按1∶10(g/mL)的比例加入0.05 mol/L的HCl溶液,室溫?cái)嚢杞?0 min后流水洗至中性,瀝干,魚皮打漿,漿液置于60 ℃恒溫水浴加熱5 h后,10 000 r/min離心20 min,取上清液,記下膠液的質(zhì)量,凱氏定氮法測定膠液中蛋白含量。

    取一定質(zhì)量的羅非魚皮膠液,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%(按膠液蛋白含量為基底)的蛋白酶,在其各自最優(yōu)的酶解條件(表1)下酶解1、2、4、6、8 h,期間保持pH值穩(wěn)定,酶解完成后沸水浴加熱15 min滅酶,冷卻后抽濾,10 000 r/min離心10 min,取上清液冷凍干燥即為TSPP。

    表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Optimal enzymatic conditions for the proteases tested in this study

    1.3.2 水解度及Fe2+結(jié)合率的測定

    利用凱氏定氮法測定魚皮總氮質(zhì)量M1(g),自動(dòng)電位滴定法測定酶解液中氨基態(tài)氮的質(zhì)量M2(g),水解度按式(1)計(jì)算:

    Fe2+結(jié)合率通過菲咯嗪比色法測得,參照Wu Haohao等[14]的方法并稍作修改,利用乙酸鈉緩沖液(0.2 mol/L,pH 5.0)配制5 mg/mL的樣品溶液,取700 μL樣品溶液與100 μL硫酸亞鐵溶液(0.2 mmol/L)混合于96 孔板中,37 ℃保溫2 h后,加入200 μL菲咯嗪溶液(5 mmol/L),室溫下放置10 min后,用酶標(biāo)儀讀取562 nm波長處的吸光度,將酪蛋白的胰蛋白酶酶解物及谷胱甘肽作為陽性對照[14],F(xiàn)e2+結(jié)合率按式(2)計(jì)算:

    式中:A0為加等體積水的吸光度;A1為加樣品后的吸光度。

    1.3.3 TSPP與Fe2+結(jié)合條件的優(yōu)化

    以結(jié)合時(shí)間120 min、pH 5、溫度37 ℃為基礎(chǔ)結(jié)合條件,測定不同結(jié)合時(shí)間(15、30、60、90、120、150、180、210、240 min)、pH值(4、5、6、7)、溫度(4、25、37、60 ℃)對結(jié)合率的影響。

    1.3.4 TSPP與Fe2+結(jié)合過程中熒光光譜掃描

    分別將在不同條件下完成結(jié)合反應(yīng)的樣品溶液進(jìn)行熒光光譜掃描,激發(fā)波長為275 nm,發(fā)射光譜掃描范圍為290~500 nm,間距為0.2 nm。

    1.3.5 TSPP與TSPP-Fe2+結(jié)合物的紫外光譜掃描

    分別將乙酸鈉緩沖液(0.2 mol/L,pH 5)、0.2 mol/L的FeSO4溶液(過濾前后)、5 mg/mL的TSPP溶液、TSPP+FeSO4溶液(過濾前后)以及5 mg/mL的TSPP-Fe2+結(jié)合物溶液進(jìn)行紫外光譜掃描。

    1.3.6 TSPP及TSPP-Fe2+結(jié)合物的紅外光譜掃描

    分別將TSPP、TSPP-Fe2+結(jié)合物與溴化鉀按1∶5的質(zhì)量比進(jìn)行研磨壓片,進(jìn)行紅外光譜掃描。

    1.3.7 分子質(zhì)量分布的測定

    采用高效體積排阻色譜法測定肽的分子質(zhì)量分布,參照Guo Lidong等[12]方法并略作修改,流動(dòng)相為乙腈(含0.1%三氟乙酸)-水(含0.1%三氟乙酸)體積比20∶80,檢測波長為214 nm,進(jìn)樣體積20 μL(2 mg/mL),流速0.5 mL/min。不同相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)樣品(細(xì)胞色素C,Mr12 400;桿菌肽,Mr6 511.44;抑肽酶,Mr1 422.69;氧化型谷胱甘肽,Mr612.63;還原型谷胱甘肽,Mr307.3)用流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合液,0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣,將制備的混合標(biāo)準(zhǔn)品樣品在色譜條件下分析,以相對保留時(shí)間(t)為橫坐標(biāo),分子質(zhì)量對數(shù)(lgMr)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,相同的條件下檢測TSPP樣品,根據(jù)樣品的保留時(shí)間,對照標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果,計(jì)算樣品的分子質(zhì)量分布。

    1.3.8 氨基酸含量的測定

    參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。

    1.3.9 TSPP及TSPP-Fe2+結(jié)合物抗氧化能力的測定

    1.3.9.1 DPPH自由基清除能力的測定

    參照Lu Xin等[16]方法并略作修改,準(zhǔn)確吸取1.00 mL的TSPP樣品溶液(5 mg/mL)與1.00 mL的DPPH-乙醇溶液(0.15 mmol/L,用95%的乙醇溶液溶解)混勻,在室溫下避光反應(yīng)30 min,于517 nm波長處測定溶液吸光度As,空白組為1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液,加入1 mL樣液混合,在517 nm波長處測定吸光度Ab,對照組為1 mL的DPPH溶液加上1 mL 95%乙醇溶液,在517 nm波長處測定其吸光度Ac,以谷胱甘肽作陽性對照,DPPH自由基清除率按式(3)計(jì)算:

    1.3.9.2 Trolox等效抗氧化能力的測定

    參照試劑盒說明書測定樣品的Trolox等效抗氧化能力。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用表示,結(jié)果間的差異性采用單因素方法分析(one-way ANOVA),隨后進(jìn)行Tukey多重比較,P<0.05,差異顯著;采用Origin 9軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TSPP的Fe2+結(jié)合活性

    由圖1可知,在5 種蛋白酶作用下,羅非魚皮蛋白水解度均隨酶解時(shí)間的延長而逐漸增大。5 種蛋白酶對羅非魚皮蛋白水解度由小到大依次為胃蛋白酶<胰蛋白酶<堿性蛋白酶<中性蛋白酶<復(fù)合蛋白酶,其中復(fù)合蛋白酶8 h的水解度最高,為26.39%。由圖2可知,羅非魚皮蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解(1~8 h)得到的TSPP其Fe2+結(jié)合率均高于其他4 種蛋白酶的酶解物,且胰蛋白酶2 h的酶解物TSPP其Fe2+結(jié)合率最高((83.47±0.1)%),且顯著高于酪蛋白酶解物(46.66±0.68)%和谷胱甘肽(17.71±0.46)%(P<0.05)。

    圖1 不同蛋白酶的水解度隨時(shí)間的變化Fig. 1 Changes in degree of hydrolysis of tilapia skin protein during hydrolysis with different proteases

    圖2 各酶解物TSPP的Fe2+結(jié)合率Fig. 2 Fe2+-chelating rates of hydrolysates with different hydrolysis times

    綜合Fe2+結(jié)合能力及水解度趨勢可知,TSPP的Fe2+結(jié)合能力不隨水解度的增加而增加,酶解時(shí)間短不能完全酶解蛋白,而酶解時(shí)間過長,生成的游離氨基酸增加,降低結(jié)合活性。不同蛋白酶具有不同的酶活力及酶切位點(diǎn),其對蛋白的水解程度不同,進(jìn)而影響酶解物TSPP的分子質(zhì)量大小、氨基酸組成及氨基酸序列,胰蛋白酶作為肽鏈內(nèi)切酶,主要作用于肽鏈中精氨酸或賴氨酸殘基的羧基端[17]。根據(jù)圖2結(jié)果,胰蛋白酶2 h的酶解物TSPP具有最高的Fe2+結(jié)合活性,因此選取胰蛋白酶2 h的TSPP進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

    2.2 TSPP與Fe2+結(jié)合條件的確定

    TSPP與Fe2+的配位結(jié)合反應(yīng)受pH值、溫度、時(shí)間等因素的影響。由圖3可知,當(dāng)pH值為7時(shí),TSPP與Fe2+的結(jié)合率極低;當(dāng)pH值小于7時(shí),結(jié)合率在結(jié)合反應(yīng)的前90 min隨結(jié)合時(shí)間的延長而大幅度上升,且pH值為5時(shí)的結(jié)合率高于pH值為4和6的結(jié)合率;而在結(jié)合反應(yīng)的90~180 min內(nèi),結(jié)合率無顯著性變化,即結(jié)合反應(yīng)基本完成,最佳的反應(yīng)pH值為5,時(shí)間為90 min。在一定pH值范圍內(nèi),隨著pH值升高,TSPP與Fe2+的結(jié)合率升高,當(dāng)pH值大于7時(shí)結(jié)合率降低,原因是在低pH值條件下,H+易與Fe2+競爭供電子基團(tuán),不利于TSPP-Fe2+結(jié)合物的生成,而在高pH值條件下,羥基易與供電子基團(tuán)爭奪Fe2+而形成氫氧化物沉淀[18]。

    圖3 不同pH值條件下結(jié)合率隨時(shí)間的變化Fig. 3 Changes in Fe2+-chelating rate over time under different pH conditions

    圖4 不同溫度條件下結(jié)合率隨時(shí)間的變化Fig. 4 Changes in Fe2+-chelating rate over time under different temperature conditions

    溫度既能夠引起TSPP構(gòu)象的改變[19],又能夠影響配位基團(tuán)與金屬離子結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)[20]。在不同溫度條件下,TSPP的Fe2+結(jié)合率隨著反應(yīng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化如圖4所示,在一定范圍內(nèi),隨著溫度的升高,結(jié)合率升高,當(dāng)溫度為37 ℃時(shí),結(jié)合率最高,當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí),結(jié)合率降低,即升高或降低溫度均造成鳀魚TSPP-Fe2+結(jié)合能力的下降,該結(jié)果與Wu Haohao等[14]的結(jié)果一致。

    因此,綜合pH值、溫度及時(shí)間考慮,pH 5、溫度37 ℃、反應(yīng)時(shí)間90 min為最佳結(jié)合反應(yīng)條件。

    2.3 TSPP與Fe2+結(jié)合過程的熒光光譜分析

    在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的研究中,內(nèi)源性熒光發(fā)射強(qiáng)度的下降是典型的肽鏈折疊后的現(xiàn)象,且當(dāng)正電基團(tuán)靠近肽鏈酪氨酸殘基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí),蛋白質(zhì)內(nèi)源性熒光光譜會(huì)發(fā)生紅移[21]。圖5為激發(fā)波長為275 nm時(shí),TSPP與Fe2+結(jié)合反應(yīng)過程的熒光發(fā)射光譜變化(290~500 nm)。由圖5A可知,隨著TSPP與Fe2+結(jié)合反應(yīng)的進(jìn)行,TSPP的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度逐漸下降,尤其是在結(jié)合反應(yīng)的0~90 min內(nèi),熒光強(qiáng)度明顯降低,且光譜發(fā)生了一定的紅移;90~150 min內(nèi),熒光強(qiáng)度下降的幅度明顯減小,說明90 min后結(jié)合反應(yīng)基本完成。由圖5B可知,當(dāng)結(jié)合反應(yīng)的pH值為5時(shí),TSPP的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度最低,說明在此pH值條件下,TSPP結(jié)合了Fe2+,多肽鏈發(fā)生了折疊,且TSPP的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度由小到大依次為pH 5<pH 6<pH 4<pH 7。如圖5C所示,當(dāng)結(jié)合反應(yīng)的溫度為37 ℃,反應(yīng)完成后TSPP的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度最低。綜上可知,當(dāng)反應(yīng)的pH值為5、溫度為37 ℃、反應(yīng)時(shí)間為90 min時(shí),TSPP的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度基本達(dá)到最低,即結(jié)合反應(yīng)基本完成,與2.2節(jié)結(jié)果一致,即最佳的結(jié)合條件為:pH 5、溫度37 ℃、時(shí)間90 min。

    圖5 不同條件下TSPP結(jié)合Fe2+后其熒光強(qiáng)度的變化Fig. 5 Changes in fluorescence intensity of tilapia skin protein peptides(TSPP) after chelating with Fe2+ under different conditions

    金屬離子在蛋白質(zhì)和多肽鏈的折疊過程中起重要作用,特別在肽鏈較短時(shí),金屬離子可輔助TSPP在水溶液中形成熱力學(xué)穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)[22]。Reddi等[23]研究也表明,TSPP與金屬離子的結(jié)合能可為TSPP的折疊提供能量輔助。肽鏈中含有的芳香族氨基酸如Phe、Trp和Tyr,可產(chǎn)生內(nèi)源性熒光,TSPP與Fe2+發(fā)生結(jié)合反應(yīng)后,肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,熒光強(qiáng)度的降低可反映出肽-鐵結(jié)合物在形成過程中發(fā)生了肽的折疊[24]。本研究結(jié)果表明,F(xiàn)e2+與肽鏈的結(jié)合引起了肽鏈折疊,形成TSPP-Fe2+結(jié)合物,此結(jié)果與李博等[25]的研究結(jié)果一致。

    2.4 TSPP及TSPP-Fe2+結(jié)合物的紫外光譜分析

    在TSPP與金屬離子的結(jié)合反應(yīng)中,TSPP作為配位體,結(jié)合金屬離子后,相應(yīng)原子的價(jià)電子發(fā)生不同程度的躍遷,導(dǎo)致其紫外光吸收性能發(fā)生改變,由此證明TSPP與金屬離子之間發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)[26]。由圖6可知,F(xiàn)e2+的乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)在230~350 nm波長處形成特征性的寬吸收帶,該溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,其紫外吸收光譜與乙酸鈉緩沖液的光譜基本一致,特征性吸收帶消失,說明Fe2+在乙酸鈉緩沖液中水解形成了鐵氫氧化物沉淀。緩沖液+TSPP+Fe2+的反應(yīng)溶液在250~280 nm波長處形成特征性的吸收帶,且反應(yīng)溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾前后,其紫外吸收帶基本一致,說明Fe2+在含有TSPP的緩沖液中不水解形成鐵氫氧化物沉淀,此外,TSPP-Fe2+結(jié)合物的紫外吸收帶與TSPP的相似,但出現(xiàn)紅移,說明TSPP介入了FeSO4在緩沖液中的水解過程,TSPP結(jié)合Fe2+后,減少了溶液中鐵氫氧化物膠體粒子的形成,而形成新物質(zhì)TSPP-Fe2+結(jié)合物,該結(jié)果與Wu Haohao等[27]研究結(jié)果相似。Yuan Biao等[28]研究也發(fā)現(xiàn),灰樹花蛋白結(jié)合Fe2+前后,其紫外最大吸收峰從194 nm移至192 nm,灰樹花-Fe2+的最大吸收波長向短波方向移動(dòng),這可能是由于Fe2+的結(jié)合過程中羰基氧原子的變化所致。

    圖6 TSPP及TSPP-Fe2+結(jié)合物的紫外光譜Fig. 6 UV absorption spectra of TSPP and TSPP-Fe2+ complex

    2.5 TSPP及TSPP-Fe2+結(jié)合物的紅外光譜分析

    紅外光譜中基團(tuán)特征性吸收峰的改變可反映出金屬離子與肽鏈中有機(jī)配位體的相互作用,且肽鏈中氨基、羰基、羧基的特征性吸收峰分別在3 300~3 600、1 600~1 700、1 400~1 500 cm-1左右[29]。由圖7可知,TSPP與Fe2+結(jié)合后,在特征區(qū),氨基的伸縮振動(dòng)吸收峰從3 317.56 cm-1移動(dòng)至3 315.63 cm-1;酰胺I帶即羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰從1 653.00 cm-1移動(dòng)至1 656.85 cm-1;羧基反對稱伸縮振動(dòng)吸收峰從1 533.41 cm-1移動(dòng)到1 537.27 cm-1,其對稱伸縮振動(dòng)峰從1 436.97 cm-1移動(dòng)到1 440.83 cm-1,且吸收峰的強(qiáng)度均有所增加。由于結(jié)合前后,肽鏈結(jié)構(gòu)構(gòu)型的改變,引起了紅外吸收峰的移動(dòng)變化,說明肽鏈中的氨基、羰基及羧基參與了Fe2+的結(jié)合,進(jìn)而形成了TSPP-Fe2+結(jié)合物。Huang Guangrong等[30]通過紅外光譜發(fā)現(xiàn)蝦加工副產(chǎn)物水解產(chǎn)物的Fe2+結(jié)合的位點(diǎn)主要對應(yīng)于羧酸酯基團(tuán)。Chen Qianru等[31]研究利用MS2技術(shù)發(fā)現(xiàn)Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly中組氨酸的咪唑環(huán)可能是潛在的Fe2+結(jié)合位點(diǎn)。林慧敏等[32]利用核磁共振及紅外光譜結(jié)構(gòu)表征顯示,肽鏈His-Tyr-Asp中的—NH—、—NH2以及末端—COOH上的—C=O及—OH與Fe2+發(fā)生結(jié)合,形成不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的結(jié)合物。Wu Haohao等[27]發(fā)現(xiàn)鳀魚蛋白Fe3+結(jié)合活性肽myosin1116-1127側(cè)鏈的羧基是Fe3+的結(jié)合位點(diǎn),即肽鏈羧基結(jié)合Fe3+形成COO—Fe,再水解形成COO—Fe(OH)n,最后脫水縮合完成晶體形成。

    圖7 TSPP及TSPP-Fe2+結(jié)合物紅外光譜Fig. 7 FTIR spectra of TSPP and TSPP-Fe2+ complexes

    2.6 TSPP的分子質(zhì)量分布

    圖8 TSPP的分子質(zhì)量分布Fig. 8 Molecular mass distribution of TSPP with different hydrolysis times

    蛋白質(zhì)在不同的酶解時(shí)間下,生成的酶解物中含有各種不同分子質(zhì)量大小的TSPP,且每一種分子質(zhì)量的TSPP在不同酶解物中的含量不同。由圖8可知,隨著胰蛋白酶酶解時(shí)間的延長,羅非魚皮蛋白酶解物中大分子質(zhì)量(>3 000 Da)的TSPP逐漸減少,小分子質(zhì)量(<3 000 Da)的TSPP逐漸增多;且2 h的酶解物中500~3 000 Da之間的TSPP含量(90.40%)高于其他酶解時(shí)間點(diǎn)下同等分子質(zhì)量的酶解物。大部分研究表明分子質(zhì)量在1 500 Da范圍內(nèi)的多肽,其Fe3+和Fe2+結(jié)合活性較高,從豬血漿蛋白水解物中鑒定出的Fe2+結(jié)合活性肽為1 055 Da[33],從核桃蛋白水解物中分離鑒定的2 條Fe3+結(jié)合活性肽的分子質(zhì)量分別為971.508 0 Da和1 357.648 0 Da[7]。結(jié)合2.2節(jié)的結(jié)果(胰蛋白酶2 h的TSPP-Fe2+結(jié)合活性最高),推測出羅非魚皮蛋白Fe2+結(jié)合活性肽的分子質(zhì)量很可能在500~3 000 Da之間。

    2.7 TSPP氨基酸含量的分析

    蛋白酶具有特殊的酶切位點(diǎn),在酶解蛋白后可生成特殊氨基酸組成及序列的多肽,從而具有特殊的生物活性。由表2可知,羅非魚皮中Asp、Glu、Gly、Ala、Arg及Pro含量較高,羅非魚皮蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解2 h后得到的TSPP,上述6 種氨基酸在其酶解物中的含量均增加了3 倍左右,且高于其他氨基酸。根據(jù)路易斯規(guī)則,充當(dāng)路易斯酸的Fe3+和Fe2+可以與富含氧或富含氮的基團(tuán)(路易斯堿)反應(yīng),如Arg、Asn中的氨基等含氮基團(tuán)或Glu、Asp中的羧基和磷酸基等含氧基團(tuán)[34]。紀(jì)曉雯等[10]分離出的酪蛋白Fe2+結(jié)合活性肽富含Glu、Asp、Gln。Budseekoad等[8]發(fā)現(xiàn)Pro-Ala-Ile-Asp-Leu與Fe2+結(jié)合的能力可能與肽鏈中的Pro、Asp和Leu中的吡咯烷環(huán)、羧基和烷基的協(xié)同效應(yīng)有關(guān)。Wu Haohao等[14]從鳀魚肌肉蛋白的胰蛋白酶水解物中分離并表征出的Fe3+結(jié)合活性肽Ser-(Gly)7-Leu-Gly-Ser-(Gly)2-Ser-Ile-Arg、Ile-(Glu)2-Leu-(Glu)3-Ile-Glu-Ala-Glu-Arg,其Glu和Gly含量占肽鏈氨基酸總量60%及以上。綜上說明,酶解物中的Asp、Glu、Gly、Arg及Pro在Fe2+結(jié)合活性中起重要作用。

    表2 羅非魚皮和TSPP中氨基酸的成分及含量Table 2 Amino acid composition of tilapia skin protein and 2 h trypsin hydrolysate

    2.8 TSPP及TSPP-Fe2+結(jié)合物的抗氧化能力分析

    Fe2+結(jié)合活性肽及肽-Fe2+結(jié)合物的主要作用是促進(jìn)鐵元素在人體中的吸收,除此之外,還具有抗氧化活性[35]。由圖9可知,5 mg/mL質(zhì)量濃度下的TSPP對DPPH自由基具有一定的清除能力,且胰蛋白酶各酶解時(shí)間點(diǎn)下的TSPP,其DPPH自由基清除能力均高于其他蛋白酶的TSPP;此外,TSPP結(jié)合Fe2+形成TSPP-Fe2+結(jié)合物后,其DPPH自由基清除率由42.47%降低為37.63%,變化不顯著,但均顯著低于谷胱甘肽(95.97%)。由圖10可知,在Trolox等效抗氧化能力中,堿性蛋白酶酶解8 h TSPP的等效抗氧化能力高于其他TSPP,此外,TSPP結(jié)合Fe2+后,其Trolox等效抗氧化能力從0.014 2 mmol/L降低為0.011 5 mmol/L,均顯著低于谷胱甘肽(0.849 1 mmol/L)。研究指出,TSPP的抗氧化活性與肽鏈中的氨基酸組成及含量息息相關(guān),大多數(shù)抗氧化肽富含Trp、Phe、Leu、Gly、Val等疏水性氨基酸以及Tyr、Phe、Trp等芳香族氨基酸,疏水性氨基酸殘基通過提供電子或供體電子穩(wěn)定活性自由基,芳香族氨基酸殘基可作為氫供體,抑制自由基介導(dǎo)的過氧化鏈反應(yīng),肽的支鏈氨基酸(Val、Leu和Ile)和非極性脂肪族氨基酸(Leu和Ala)對肽的抗氧化活性也有很大的貢獻(xiàn)[36-38]。綜合TSPP氨基酸組成及含量的結(jié)果,TSPP中主要含有Asp、Glu、Gly、Arg及Pro,在Fe2+結(jié)合活性中,TSPP的結(jié)合活性高于谷胱甘肽,而在抗氧化活性中,谷胱甘肽的活性高于TSPP,由此說明,不同的TSPP具有不同的氨基酸組成及含量,決定其特殊的生物活性。

    圖9 TSPP及TSPP-Fe2+結(jié)合物的DPPH清除活性Fig. 9 DPPH scavenging activity of TSPP and TSPP-Fe2+ complexes

    圖10 TSPP及TSPP-Fe2+結(jié)合物的Trolox等效抗氧化能力Fig. 10 Trolox equivalent antioxidant capacity of TSPP and TSPP-Fe2+ complexes

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)以羅非魚皮為原料,進(jìn)行了羅非魚皮蛋白TSPP-Fe2+結(jié)合物的制備及其結(jié)合條件、結(jié)構(gòu)特征、生物活性的探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSPP的Fe2+結(jié)合活性不隨蛋白水解度的增加而增加,且胰蛋白酶酶解2 h的TSPP,其Fe2+結(jié)合率最高;TSPP與Fe2+的結(jié)合率受pH值、溫度和時(shí)間的影響,當(dāng)pH值為5、溫度為37 ℃、時(shí)間為90 min時(shí),結(jié)合反應(yīng)基本完成;TSPP結(jié)合Fe2+后,其內(nèi)源性熒光強(qiáng)度降低且光譜發(fā)生紅移,說明結(jié)合后,肽鏈發(fā)生了折疊;TSPP結(jié)合Fe2+前后,其紫外光吸收帶的位移表明TSPP結(jié)合Fe2+后形成了新物質(zhì);根據(jù)TSPP及TSPP-Fe2+結(jié)合物的紅外光譜推測出肽鏈中的氨基、羰基、羧基參與了Fe2+的結(jié)合;TSPP中的Fe2+結(jié)合活性肽,其分子質(zhì)量大約在500~3 000 Da之間;此外,肽鏈中的Asp、Glu、Gly、Arg及Pro在Fe2+結(jié)合活性中起關(guān)鍵作用;TSPP具有一定的抗氧化能力,但TSPP的抗氧化能力顯著低于谷胱甘肽,而其Fe2+結(jié)合能力顯著高于谷胱甘肽,說明不同的肽段具有不同的氨基酸組成及含量,進(jìn)而決定了其生物活性的特異性。由于蛋白酶解物中含有各種不同分子質(zhì)量大小及氨基酸組成的肽段,需對其進(jìn)行分離純化、序列鑒定以及生物利用度的測定,以期為膳食鐵元素補(bǔ)充劑的研究及開發(fā)提供依據(jù)。

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