包封姜黃素的果膠-核桃蛋白復(fù)合物乳液穩(wěn)定性及體外消化

呂思伊，盧 琪，潘思軼,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北省藥品監(jiān)督管理局技術(shù)審評核查中心，湖北 武漢 430070；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430070）

姜黃素（curcumin，CCM）是姜黃根莖中的天然親脂性多酚。前期研究證實(shí)CCM是一種生物活性化合物，可促進(jìn)多種藥理活性，例如抗氧化劑、抗癌藥和抗炎藥[1]。然而，CCM的水溶性低，生物利用度差，極大限制了其在功能性食品和營養(yǎng)保健品配方中的應(yīng)用[2]。在提高CCM應(yīng)用范圍的方法中，基于多糖-蛋白聚合物的包封是具有廣闊前景的新型配方，可以提高親脂性多酚的溶解度并保護(hù)它們免受環(huán)境壓力的影響[3]。

蛋白質(zhì)由于具有生物可降解性和生物相容性，是制造乳液的主體材料。在過去的十年中，許多研究表明，動物衍生的蛋白質(zhì)分子可以充當(dāng)載體改善CCM的溶解度和生物利用度[4]。但是，大量研究表明，這些動物蛋白有常見的食物過敏原[5]。因此，研究人員試圖尋找植物衍生的蛋白質(zhì)替代這些動物衍生的蛋白質(zhì)?；贑CM使用動物源蛋白的包封技術(shù)，植物源蛋白也被用于包封CCM，例如大豆分離蛋白[6]、玉米蛋白[7]和亞麻籽蛋白水解物[8]，結(jié)果表明，通過使用這些植物來源的蛋白質(zhì)進(jìn)行包封，CCM的溶解性和穩(wěn)定性可以得到顯著改善。核桃蛋白（walnut proteins，WNPs）中賴氨酸含量相對較低，精氨酸含量較高。平均賴氨酸/精氨酸比例遠(yuǎn)低于其他常見蛋白質(zhì)。而精氨酸可以轉(zhuǎn)化為一氧化氮，抑制血小板黏附和聚集，是有效的血管擴(kuò)張劑[9]。因此，WNPs被認(rèn)為是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。盡管如此，沒有發(fā)現(xiàn)WNPs用于封裝CCM。這是由于WNPs低溶解度造成。

果膠（pectin，PT）是一種來自植物細(xì)胞壁的陰離子多糖，通過添加PT可以提高單個蛋白的穩(wěn)定性[10]。因此通過添加PT提高WNPs乳液穩(wěn)定性。然而，目前幾乎沒有關(guān)于包封CCM的PT-WNPs復(fù)合物乳液穩(wěn)定性的研究。因此，在本研究中，將CCM包封在PT-WNPs組分復(fù)合物中形成乳液，并研究包封CCM的PT-WNPs組分復(fù)合物乳液的穩(wěn)定性和體外消化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆和田薄皮核桃（Juglans legiaL.）購自新疆農(nóng)貿(mào)市場。

中鏈甘油三酯（medium chain triglycerides，MCT）、PT、異硫氰酸熒光素、尼羅紅、CCM、黏蛋白、胃蛋白酶（USP級，1∶30 000）、胰酶（生物級，1∶4 000）、膽鹽 上海源葉生物科技有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純；所有化學(xué)試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EL204-IC電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；Master微流變儀 法國Formulaction儀器公司；JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；MICCRA-9高剪切探針均質(zhì)機(jī) 德國工業(yè)品質(zhì)流體公司；Leica TCS SP2激光共聚焦掃描顯微鏡 德國萊卡公司；T21紫外-可見分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；Mastersizer 2000粒徑分布儀、ZEN 3600電位-粒度分析儀英國馬爾文公司；Ti-S熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 包封CCM的PT-WNPs復(fù)合物乳液的制備

核桃仁浸泡去皮后40 ℃烘干、粉碎。采用正己烷反復(fù)萃取進(jìn)行脫脂直至澄清[11]。將脫脂的核桃在通風(fēng)櫥中風(fēng)干過夜，以除去殘留的溶劑。粉碎后過40 目篩，即為核桃脫脂粉，然后將其貯存在-20 ℃氣袋中備用。通過前期研究的超聲輔助提取方法制備不同的WNPs組分（WNPs包括清蛋白、球蛋白、谷蛋白，蛋白質(zhì)含量為80%）[12]。將脫脂的核桃粉（1∶30（g/mL））分散在蒸餾水中，使用直徑為0.636 cm鈦探針的超聲細(xì)胞破碎儀對30 mL WNPs漿液進(jìn)行超聲處理（200 W，20 min）。然后，將漿液在4 ℃、10 000×g離心30 min，收集上清液，并將沉淀物用于下一步WNPs的提取。將沉淀物依次分散在1.0 mol/L NaCl和0.1 mol/L NaOH溶液中，并使用上述方法進(jìn)行球蛋白和谷蛋白的提取。用0.5 mol/L HCl將上清液的pH值調(diào)節(jié)至8.0，用去離子水透析48 h，然后凍干。

將每種樣品粉末溶解在含有0.02%疊氮化鈉作為抗微生物劑的去離子水中，在室溫下磁力攪拌（500 r/min）4 h獲得0.2% PT（高甲氧基，65%，柑橘來源）和0.8% WNPs不同組分的混合物，生物復(fù)合物總量固定為1.0%。然后在4 ℃過夜。在進(jìn)一步混合之前，使用0.1 mol/L NaOH將WNPs和PT溶液的pH值調(diào)節(jié)至8.0貯存。將0.1% CCM添加到MCT油中避光磁力攪拌過夜。將油-CCM混合物在12 000×g離心15 min除去未溶解的不溶物。用甲醇溶解CCM標(biāo)準(zhǔn)品，通過紫外-可見分光光度計(jì)在428 nm波長下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制的CCM標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.135 6X-0.041 8，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 3。用紫外分光光度法測定油相中CCM的含量為503 mg/g。

將富含CCM的MCT油0.5 mL（體積分?jǐn)?shù)10%）添加到混合液4.5 mL中。使用高剪切探針均質(zhì)機(jī)以19 000 r/min均質(zhì)2 min，制備初級乳液。使用超聲處理器（直徑0.636 cm的鈦探針）超聲4 min（有效處理時間）制備乳液。高場強(qiáng)超聲頻率、振幅和脈沖持續(xù)時間分別設(shè)置為20 kHz，40%和2 s超聲時間＋2 s斷開時間。

1.3.2 乳液的表征

1.3.2.1 粒徑分析

制備細(xì)乳液后立即測定乳液樣品的粒徑[13]。使用Mastersizer 2000粒徑分析儀確定乳液的粒度。折射率為1.330，吸收參數(shù)為0.001，泵速為2 000 r/min。粒徑表示為表面加權(quán)平均直徑（D3,2）和體積加權(quán)平均直徑（D4,3）的3 個讀數(shù)的平均值。

1.3.2.2 Zeta電位測定

在25 ℃下，使用去離子水將乳液稀釋100 倍，然后使用DTS-7010毛細(xì)管比色杯，通過電位-粒度分析儀測定乳液的Zeta電位值。

1.3.2.3 激光共聚焦掃描顯微鏡分析

0.1 %異硫氰酸熒光素（溶解于二甲基亞砜中）和0.1%尼羅紅（溶解于乙醇中）混合用于蛋白質(zhì)和油脂分別染色。將20 μL染料混合物添加到1 mL乳液中。使用激光共聚焦掃描顯微鏡檢查超聲處理乳液的結(jié)構(gòu)。使用在488 nm和633 nm激發(fā)波長下工作的Ar-Kr離子激光器和He-Ne激光器分別對油滴和蛋白質(zhì)成像。使用油浸物鏡以100放大倍率進(jìn)行觀察。

1.3.3 乳液的穩(wěn)定性

1.3.3.1 貯存時間對乳液穩(wěn)定性的影響

在室溫下貯存新鮮的包封CCM的PT-WNPs復(fù)合物乳液1、7、14 d。目視觀察研究乳液在1、7 d和14 d后的乳液穩(wěn)定性，分析乳液粒徑。

1.3.3.2 溫度對乳液穩(wěn)定性的影響

以4 ℃冰箱冷藏下包封CCM的PT-WNPs復(fù)合物乳液作為對照，考察熱處理（30、50、70 ℃和90 ℃）對乳液穩(wěn)定性的影響。使用水浴分別在30、50、70 ℃和90 ℃下將新鮮的乳液（5 mL）加熱30 min。將乳液冷卻至室溫后，分析粒徑分布、Zeta電位值和微觀結(jié)構(gòu)[14]。

1.3.3.3 鹽溶液對乳液穩(wěn)定性的影響

新鮮的包封CCM的PT-WNPs復(fù)合物乳液使用NaCl溶液（0、50、100、200 mmol/L和300 mmol/L）稀釋（乳液-NaCl（1∶1，V/V）），磁力攪拌器以120 r/min攪拌30 min。在24 h后獲得粒徑、Zeta電位值和微觀結(jié)構(gòu)[15]。

1.3.4 體外消化

采用由口腔、胃和小腸組成的三步模型評估包封CCM的PT-WNPs復(fù)合物乳液在體外的消化運(yùn)動。準(zhǔn)備模擬唾液（simulated saliva fluid，SSF）、模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）和模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）[16-17]。

口腔相：將含有5 mg/mL黏蛋白的SSF（9 mL）、3.6 g乳液和1.4 mL PBS（pH 7.0、10 mmol/L）混合。然后將混合物的pH值調(diào)節(jié)至6.8，并在搖床中于37 ℃、100 r/min持續(xù)振蕩溫育10 min。

胃相：將15 mL來自口腔相的樣品與15 mL含3.2 mg/mL胃蛋白酶的SGF混合。將混合物的pH值調(diào)節(jié)至2.5后，將其在搖床上于37 ℃、100 r/min連續(xù)振蕩溫育1 h。

小腸相：將胃相產(chǎn)生的30 mL樣品的pH值調(diào)節(jié)至7.0，然后與1.5 mL SIF混合，然后在恒定攪拌下與3.5 mL膽汁鹽溶液（5 mg/mL）混合。調(diào)節(jié)pH 7.0，加入2.5 mL 1.6 mg/mL脂肪酶溶液。然后將混合物在搖床中于37 ℃、100 r/min持續(xù)振蕩溫育2 h。在這段時間內(nèi)，通過添加NaOH溶液將系統(tǒng)的pH值維持在7.0。

1.3.4.1 乳液消化過程的理化特性

粒徑和電位測定同1.3.2.1節(jié)和1.3.2.2節(jié)方法。

消化乳液的微觀結(jié)構(gòu)使用熒光顯微鏡觀察。0.1%異硫氰酸熒光素和0.1%尼羅紅混合分別用于蛋白質(zhì)和油脂染色。將20 μL染料混合物添加到1 mL乳液。使用相機(jī)捕獲圖像。

1.3.4.2 CCM的釋放和生物利用率

乳液中CCM含量測定按照Guo Qin等[18]的方法略作修改。用乙醇適當(dāng)溶解乳液中的CCM，然后使用紫外-可見分光光度計(jì)測定波長428 nm處的吸光度。CCM含量根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。

消化完成后收集一部分消化物并離心。該步驟產(chǎn)生了三層：底部“沉淀”相，中間“膠束”相和上部“脂質(zhì)”相。CCM必須先溶解在小腸的膠束中，然后才能被吸收。然后收集膠束相以測定CCM在乳液中的生物利用率。將腸段消化后的消化物等分試樣在4 ℃、15 000 r/min離心30 min，收集中間層并視為膠束級分。

1.3.5 包封率和生物利用率的計(jì)算

包封率和生物利用率按式（1）、（2）計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有乳液進(jìn)行3 次重復(fù)分析。使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA）。單向ANOVA檢驗(yàn)和Duncan檢驗(yàn)用于顯著性分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳液表征

2.1.1 乳液粒徑和電位值

圖1 包封CCM后乳液的表面加權(quán)平均直徑（D3,2）和Zeta電位值Fig. 1 Surface-weighted mean diameter (D3,2) and zeta-potential values of emulsions encapsulating CCM

如圖1所示，當(dāng)PT-WNPs復(fù)合物包封CCM時，PT-核桃谷蛋白復(fù)合物乳液粒徑（D3,2）從（0.593±0.02） μm增加到（0.692±0.00）μm，同時Zeta電位絕對值從34.25 mV降至28.7 mV。這歸因于蛋白質(zhì)和多酚之間的反應(yīng)原理。對于CCM，在CCM分子的每個末端都有一個帶有負(fù)電荷的酚羥基[19]。蛋白質(zhì)與多酚之間的相互作用主要是通過疏水作用、范德華力、氫鍵和靜電相互作用的非共價鍵合[20]。在這些力中，靜電力比其他力強(qiáng)（復(fù)合物乳液電位值均為負(fù)）。核桃谷蛋白分子中帶正電的基團(tuán)（如賴氨酸、組氨酸等）還可以通過弱的靜電吸引作用與CCM分子中的帶負(fù)電的基團(tuán)相互作用，并中和帶正電的基團(tuán)[21]。因此，核桃谷蛋白分子和PT之間的分子間排斥以及復(fù)合物的粒徑增加。但是，蛋白分子中帶正電荷的基團(tuán)數(shù)量有限。當(dāng)這些基團(tuán)飽和時，不斷增加CCM濃度（數(shù)據(jù)未顯示），過量的CCM分子將通過疏水相互作用與蛋白分子中的疏水基團(tuán)結(jié)合。這些疏水性化合物將水從復(fù)合物中排出，從而使復(fù)合物的結(jié)構(gòu)更致密[22]。因此，PT-核桃清蛋白復(fù)合物和PT-核桃球蛋白復(fù)合物乳液粒徑減小。通過比較發(fā)現(xiàn)，這2 種復(fù)合物的Zeta電位幾乎不受CCM的影響。這歸因于CCM的Zeta電位值很?。s2 mV）。

2.1.2 乳液粒徑分布

圖2 包封CCM后乳液的粒徑分布Fig. 2 Particle size distribution of emulsions encapsulating CCM

如圖2所示，包封CCM的PT-核桃球蛋白復(fù)合物乳液雙峰消失，乳液穩(wěn)定性提高。而核桃清蛋白和核桃谷蛋白復(fù)合物乳液粒徑分布基本一致，說明包封CCM后，PT-核桃清蛋白和PT-核桃谷蛋白復(fù)合物乳液穩(wěn)定性未改變。

2.1.3 乳液微觀結(jié)構(gòu)

圖3 乳液的激光共聚焦掃描顯微鏡圖Fig. 3 Confocal laser scanning microscopy of emulsions

如圖3所示，在所有樣品中，蛋白質(zhì)都染成綠色，油相染成紅色。與未包封CCM初始乳液相比，PT-核桃清蛋白復(fù)合物乳液觀察到最小的油滴尺寸，表明最高的乳液穩(wěn)定性。這一結(jié)果與乳液粒徑（D3,2）（圖1）結(jié)果一致。相反，PT-核桃球蛋白和PT-核桃谷蛋白復(fù)合物乳液包封CCM后觀察到較大的油滴尺寸，然而油滴表面附著一圈黃色的蛋白界面層，未發(fā)現(xiàn)絮凝現(xiàn)象，表明包封CCM對乳液穩(wěn)定性沒有影響。這一結(jié)果與乳液粒徑分布（圖2）結(jié)果一致。

2.2 乳液穩(wěn)定性

2.2.1 貯存時間對乳液穩(wěn)定性的影響結(jié)果

表1 貯存時間對包封CCM后乳液的體積加權(quán)平均直徑（D4,3）和表面加權(quán)平均直徑（D3,2）的影響Table 1 Influence of storage time on volume-weighted mean diameter (D4,3)and surface-weighted mean diameter (D3,2) of emulsions encapsulating CCM

圖4 貯存時間對乳液穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Influence of storage time on stability of emulsions

如表1和圖4所示，在貯存14 d后，包封CCM的PT-WNPs復(fù)合物乳液粒徑（D4,3）略有增加，PT-核桃清蛋白乳液粒徑（D4,3）從（0.836±0.00）μm增加到（0.924±0.02）μm，PT-核桃球蛋白乳液粒徑（D4,3）從（1.086±0.00）μm增加到（1.433±0.02）μm，PT-核桃谷蛋白乳液粒徑（D4,3）從（0.831±0.00）μm增加到（1.073±0.03）μm。然而，在貯存期間，包封CCM的PT-WNPs復(fù)合物乳液中沒有觀察到相分離（圖4）。與這些結(jié)果一致的是，Porras等[23]發(fā)現(xiàn)，制備的W/O納米乳液與水/混合的非離子型表面活性劑/癸烷的液滴大小會隨時間延長，不會發(fā)生相分離、沉淀或乳化。表明液滴尺寸的增加可能歸因于Ostwald熟化和聚結(jié)機(jī)制。“Ostwald熟化”是不穩(wěn)定的過程，由于小液滴的較高溶解度和分子在連續(xù)相中的擴(kuò)散，大液滴以小液滴的生長為代價[24]。另一個原因可能是在存儲過程中液滴的聚結(jié)，因?yàn)檩^大液滴的聚結(jié)率遠(yuǎn)高于小液滴。中、大液滴變大，而小液滴仍不聚結(jié)，并且數(shù)目不斷增加。因此，在貯存期間，由于較高的Ostwald熟化和聚結(jié)速率，液滴尺寸增加。

2.2.2 溫度對乳液穩(wěn)定性的影響結(jié)果

在熱處理階段，包封CCM的PT-WNPs復(fù)合物乳液粒徑分布沒有觀察到顯著變化（圖5），顯示出單峰分布且峰形基本重合。單峰分布表明較好的乳液穩(wěn)定性，因?yàn)槿橐褐械念w粒具有相似的尺寸并均勻分布。然而，在90 ℃溫度下處理30 min后包封CCM的PT-WNPs復(fù)合物乳液粒徑增大（表2）。這一結(jié)果與觀察到乳液微觀結(jié)構(gòu)相似（圖6）。在90 ℃溫度下從激光共聚焦掃描顯微鏡顯微照片中觀察到最大的油滴尺寸。這些結(jié)果表明，雖然包封CCM的PT-WNPs復(fù)合物乳液粒徑增大，但仍然保持較好的熱穩(wěn)定性，CCM受到保護(hù)免于降解。這些結(jié)果說明：PT-WNPs復(fù)合物乳液可以在脂肪滴的表面形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并可以防止脂肪滴在熱處理過程中絮凝；大量的PT-WNPs復(fù)合物吸附在油滴表面并形成一層厚的保護(hù)層，從而保證了CCM的穩(wěn)定性。

圖5 熱處理30 min對乳液穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Influence of heat treatment for 30 min on stability of emulsions

表2 熱處理30 min對包封CCM后乳液的體積加權(quán)平均直徑（D4,3）和表面加權(quán)平均直徑（D3,2）的影響Table 2 Influence of heat treatment for 30 min on volume-weighted mean diameter (D4,3) and surface-weighted mean diameter (D3,2) of emulsions encapsulating CCM

圖6 熱處理30 min對包封CCM后乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 6 Influence of heat treatment for 30 min on the microstructure of emulsions encapsulating CCM

2.2.3 鹽溶液對乳液穩(wěn)定性的影響

如表3和圖7、8所示，包封CCM的PT-核桃清蛋白復(fù)合物乳液在0～300 mmol/L條件下非常穩(wěn)定。然而，包封CCM的PT-核桃球蛋白和PT-核桃谷蛋白復(fù)合物乳液在100 mmol/L NaCl濃度下則不穩(wěn)定，出現(xiàn)雙峰或多峰分布（圖7）。較大的粒徑主要是由于脂肪滴和復(fù)合物乳液絮凝導(dǎo)致液滴尺寸分布不均（圖8）。該結(jié)果可以通過以下事實(shí)解釋：NaCl可以增加具有CCM的乳液中液滴之間的吸引力。該吸引力隨著NaCl濃度的增加而增加，直到其高到足以克服液滴之間的排斥力為止，從而導(dǎo)致液滴絮凝。這些結(jié)果表明，CCM與核桃球蛋白和核桃谷蛋白復(fù)合物乳液的結(jié)合力較弱，以至于吸引力起主導(dǎo)作用，導(dǎo)致液滴在臨界NaCl濃度以上聚集[25]。

表3 NaCl濃度對包封CCM后乳液的體積加權(quán)平均直徑（D4,3）和表面加權(quán)平均直徑（D3,2）的影響Table 3 Influence of ionic strength on volume-weighted mean diameter (D4,3) and surface-weighted mean diameter (D3,2) of emulsions encapsulating CCM

圖7 NaCl濃度對乳液穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Influence of ionic strength on particle size distribution of emulsions

圖8 NaCl濃度對包封CCM后乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 8 Influence of ionic strength on the microstructure of emulsions encapsulating CCM

2.3 體外消化

2.3.1 乳液消化過程的理化特性

復(fù)合物乳液中功能成分的釋放特性與粒徑的變化有關(guān)[26]。通常用每種乳液的脂肪滴大小闡明在模擬消化過程中乳劑中的顆粒變化。因此，本研究中當(dāng)復(fù)合物乳液通過模擬口腔胃腸道時，測定PT-WNPs復(fù)合物乳液的粒徑、電位和微觀結(jié)構(gòu)（圖9～12）。

在模擬口腔胃腸道中溫育后，所有復(fù)合物乳液的粒徑（D3,2）和Zeta電位值均發(fā)生了明顯變化。所有復(fù)合物乳液均表現(xiàn)出相似的粒徑（D3,2）和Zeta電位值變化趨勢，即先增加后減小（圖9A）。特別是，對于包封CCM的PT-核桃清蛋白復(fù)合物乳液，在模擬口腔消化后，乳液的粒徑（D3,2）和脂肪滴大小顯著增加，在模擬胃消化60 min后觀察到廣泛的顆粒聚集（圖12），這是由于酸性條件下靜電相互作用的變化所致[27]（圖11）。盡管乳液中的蛋白可以被胃蛋白酶水解，但減少了靜電排斥和空間位阻，導(dǎo)致脂肪滴尺寸增大。相反，在模擬胃消化60 min后包封CCM的PT-核桃球蛋白復(fù)合物乳液粒徑（D3,2）未發(fā)生明顯變化（圖9A），油滴尺寸未有明顯增大（圖12），這表明PT-核桃球蛋白復(fù)合物乳液在酸性介質(zhì)中比其他復(fù)合物更穩(wěn)定，大多數(shù)PT-核桃球蛋白復(fù)合物乳液是在小腸階段消化的。而PT-核桃谷蛋白復(fù)合物乳液模擬胃消化60 min后觀察到較大的油滴尺寸，且PT-核桃谷蛋白復(fù)合物和油滴緊密結(jié)合，可以改變水相的遷移率并阻礙了胰酶接近大的脂肪滴，大的脂肪滴需要很長時間才能被水解?？梢詮脑摻Y(jié)果得出結(jié)論，PT-核桃球蛋白復(fù)合物是合適的包封材料，可以在酸性介質(zhì)中保持CCM的穩(wěn)定性，并且還可以延遲體外消化過程中CCM的釋放。

圖9 體外消化對包封CCM乳液粒徑的影響Fig. 9 Influence of in vitro digestion on the particle size of emulsions encapsulating CCM

暴露于SIF條件下在消化120 min后，發(fā)現(xiàn)PT-WNPs復(fù)合物乳液的粒徑（D3,2）顯著減?。▓D9A），而D3,2可以代表大多數(shù)顆粒的粒徑。粒徑（D4,3）大小明顯增加（圖9B）說明不溶性聚集體的增加。結(jié)果表明，較小的液滴尺寸比較大的液滴尺寸具有更大的脂質(zhì)水解速率和程度，因此在模擬的腸道條件下，較小的脂肪液滴數(shù)量在消化120 min內(nèi)迅速減少。乳液中殘留的大脂肪滴導(dǎo)致脂肪滴尺寸增加（圖12）。乳液中殘留的大脂肪滴聚集和SIF中的膽鹽導(dǎo)致脂肪滴絮凝[28]。液滴尺寸的分布還表明，在SIF條件下消化120 min后，PT-WNPs復(fù)合物乳液中較小的脂肪液滴數(shù)量減少（圖10）。先前研究支持了這一點(diǎn)，即乳液中的液滴尺寸越小，脂質(zhì)水解的速率和程度越大。這將導(dǎo)致乳液中脂肪酶接觸的油滴界面面積較小[29-30]。和胃液中相比較PT-核桃清蛋白復(fù)合物乳液粒徑（D4,3）減少，說明大部分PT-核桃清蛋白復(fù)合物乳液是在胃階段消化的?？梢詮脑摻Y(jié)果得出結(jié)論，PT-核桃清蛋白復(fù)合物是一種快速釋放活性物質(zhì)的包封材料，可以在消化過程中快速補(bǔ)充人體所需能量。

圖10 體外消化對乳液粒徑分布的影響Fig. 10 Influence of in vitro digestion on particle size distribution of emulsions

圖11 體外消化對包封CCM乳液Zeta電位值的影響Fig. 11 Influence of in vitro digestion on zeta-potential value of emulsions encapsulating CCM

圖12 體外消化對包封CCM乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 12 Influence of in vitro digestion on the microstructure of emulsions encapsulating CCM

2.3.2 乳液消化過程的理化特性

如圖13所示，在SGF條件下，這些復(fù)合物乳液被胃蛋白酶的剪切破壞，復(fù)合物乳液中的CCM在胃消化中釋放出來。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于PT-核桃球蛋白復(fù)合物乳液，在口腔和胃的消化過程中CCM釋放率為32.88%，釋放速度比其他復(fù)合物乳液慢。Guo Qing等[18]也發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白和PT復(fù)合物乳液能夠延遲CCM在胃中的消化。這些結(jié)果與乳液粒徑（圖9）和液滴尺寸（圖12）一致。而在SIF條件下消化120 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PT-核桃球蛋白復(fù)合物乳液中的CCM大量釋放，在腸消化后釋放率為84.58%，這是由于PT-核桃球蛋白復(fù)合物乳液中有更多未消化的小脂肪滴（圖12C），這將導(dǎo)致乳液中脂肪酶接觸油滴的界面面積較小，能夠促進(jìn)脂肪酶進(jìn)入脂質(zhì)滴表面的能力。而PT-核桃谷蛋白復(fù)合物乳液中大的脂肪滴需要很長時間才能被水解，從而阻礙了CCM的釋放，PT-核桃谷蛋白復(fù)合物乳液的釋放率為64.53%。可以從該結(jié)果得出結(jié)論，PT-核桃球蛋白復(fù)合物是合適的包封材料，可以在酸性介質(zhì)中保持CCM的穩(wěn)定性，延遲體外消化過程中CCM的釋放，提高生物利用率，從而更好被小腸吸收。

假定CCM最終在膠束階段是可生物利用的。因?yàn)榛旌夏z束能夠通過中空纖維膜，而未消化的乳液則不能。收集膠束相以測定CCM在乳液中的生物利用率。PT-核桃球蛋白復(fù)合物乳液中CCM的生物利用率（（60.40±2.10）%）高于PT-核桃清蛋白復(fù)合物乳液（（58.16±1.52）%）和PT-核桃谷蛋白復(fù)合物乳液（（38.06±0.58）%）（圖13B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合物乳液可通過這種機(jī)制增加CCM的生物利用率。它們可能阻止油滴在胃相中聚集，從而促進(jìn)脂肪酶進(jìn)入脂質(zhì)滴表面的能力。

圖13 乳液中CCM在體外消化過程中的釋放量（A）和生物利用率（B）Fig. 13 Release (A) and bioaccessibility (B) of encapsulated CCM from emulsions during in vitro digestion

3 結(jié) 論

CCM被成功地包封在由WNPs和PT組成的復(fù)合物乳液中。包封CCM的PT-核桃清蛋白復(fù)合物乳液是一種較好的營養(yǎng)補(bǔ)充劑，在高溫和高鹽貯存環(huán)境下，能夠保持CCM的穩(wěn)定性。在體外消化的過程中，PT-核桃清蛋白復(fù)合物乳液能夠快速釋放活性物質(zhì)，從而及時補(bǔ)充人體所需能量。包封CCM的PT-核桃球蛋白復(fù)合物乳液是合適的包封材料，可以在酸性介質(zhì)中保持CCM的穩(wěn)定性，延遲體外消化過程中CCM的釋放，提高生物利用率，從而更好被小腸吸收。而PT-核桃谷蛋白復(fù)合物乳液可以延遲體外消化過程中CCM的釋放，并且生物利用率低。因此，可以認(rèn)為PT-WNPs復(fù)合物可能是一種有效的生物活性化合物遞送系統(tǒng)，然而不同PT-WNPs組分復(fù)合物乳液在不同功能食品中應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。