105例呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎患者肺炎克雷伯菌臨床與微生物學(xué)特征分析*

許晶晶， 韋 娜△， 付敬杰， 肖 琳， 寇俊娜， 張慧峰， 郭 思

1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，2河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450052 河南省人民醫(yī)院 3重癥醫(yī)學(xué)科 4檢驗(yàn)科，鄭州 4500035阜外華中心血管病醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450003

呼吸機(jī)相關(guān)肺炎(ventilator associated pneumonia，VAP)是常見的醫(yī)院內(nèi)感染，其發(fā)生率為8%～28%[1]。而且，研究證實(shí)VAP的病死率為24%～76%，高于其他類型的醫(yī)院內(nèi)感染。肺炎克雷伯菌是社區(qū)和醫(yī)院感染中常見的致病菌，可以引起肺炎、腹部感染、尿路感染、導(dǎo)管相關(guān)感染等。肺炎克雷伯菌根據(jù)其黏液表型分為經(jīng)典肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKP)和高黏液性肺炎克雷伯菌[hypervirulent(hypermucoviscous)Klebsiellapneumoniae，hvKP]，其中cKP是造成醫(yī)院感染的主要病原菌[2]。hvKP是近年來發(fā)現(xiàn)的一種強(qiáng)致病力肺炎克雷伯菌的新型變種，其致病力、侵襲性顯著強(qiáng)于cKP，故也被命名為高毒力肺炎克雷伯菌[3-4]。與cKP不同的是，hvKP主要造成社區(qū)性感染，能夠在健康人群中引起威脅生命的感染，這種情況已引起世界范圍內(nèi)的重視[3]。近年來，我國關(guān)于hvKP感染的報(bào)道逐年增加[5-6]。但是大多數(shù)研究都集中在hvKP引起的社區(qū)獲得性感染。然而，關(guān)于hvKP引起VAP感染的臨床及微生物學(xué)特征的研究報(bào)道少見。本研究以呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎患者中分離的肺炎克雷伯菌為研究對(duì)象，對(duì)其高黏液性、耐藥性、莢膜血清型、相關(guān)毒力基因和多位點(diǎn)分型(MLST)進(jìn)行了分析，以便為臨床用藥及控制其傳播提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及臨床數(shù)據(jù)收集

收集2013年1月至2018年12月在河南省人民醫(yī)院ICU臨床診斷為VAP，并且肺泡灌洗液中分離鑒定的肺炎克雷伯菌≥104CFU/mL患者的臨床資料，并將分離所得肺炎克雷伯菌作為本研究的實(shí)驗(yàn)菌株。VAP診斷標(biāo)準(zhǔn)為：機(jī)械通氣>48 h或拔管<48 h內(nèi)發(fā)生肺炎，與機(jī)械通氣之前比較，患者肺部出現(xiàn)新的浸潤性陰影或炎癥病灶，肺實(shí)變征和(或)濕性羅音。并具備以下條件之一者：①外周血白細(xì)胞>10×109/L或<4×109/L；②體溫>37.5℃，呼吸道分泌物增多且有膿性；③肺泡灌洗液連續(xù)2次培養(yǎng)出同一致病菌。多重細(xì)菌感染所造成的VAP患者不納入本研究。臨床數(shù)據(jù)的收集包括年齡、性別、機(jī)械性通氣時(shí)間、基礎(chǔ)疾病等。

1.2 主要儀器和試劑

Vitek 2 compact全自動(dòng)微生物鑒定儀(法國梅里埃生物公司)，PCR儀(德國Eppendorf公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，PCR試劑盒、DNA Marker、ExTaq酶購自大連TaKaRa公司。PCR擴(kuò)增引物與雙向測(cè)序由Invitrogen公司完成。

1.3 菌株鑒定及抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

細(xì)菌鑒定采用VITEK-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀?？咕幬锏拿舾行圆捎肰ITEK-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀與紙片擴(kuò)散法(K-B法)。藥敏結(jié)果判斷參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所CLSI 2014 M100-S24的推薦標(biāo)準(zhǔn)[7]。采用雙紙片協(xié)同試驗(yàn)進(jìn)行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)檢測(cè)。大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作為質(zhì)控菌株。

1.4 高黏液性(hypermucoviscosity，HM)表型試驗(yàn)

將肺炎克雷伯菌接種于含5%羊血的瓊脂平板上，置于CO2培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)16～18 h后，用細(xì)菌接種環(huán)輕輕向上挑起菌落，如挑起黏液絲≥5 mm[3]，則為HM表型陽性。

1.5 莢膜血清分型及相關(guān)毒力基因檢測(cè)

PCR檢測(cè)莢膜血清型(K1、K2)及相關(guān)毒力基因rmpA和aerobactin，引物與擴(kuò)增條件參見文獻(xiàn)[8-9]。

1.6 多位點(diǎn)序列分型(MLST)

應(yīng)用MLST對(duì)檢出的肺炎克雷伯菌進(jìn)行基因分型。擴(kuò)增肺炎克雷伯菌基因組上的7個(gè)管家基因：gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB，然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。在http：//pubmlst.org/kpneumoniae網(wǎng)址上，比對(duì)確定菌株的等位基因譜和序列型(STs)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，率的組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用WHONET 5.6軟件統(tǒng)計(jì)分析細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌的高黏液表型

肺炎克雷伯菌的菌落通常濕潤、光滑，部分菌落具有高黏液性狀。105株肺炎克雷伯菌中，24.8%(26/105)為hvKP，拉絲試驗(yàn)為陽性。

2.2 肺炎克雷伯菌相關(guān)VAP患者臨床特征

本研究回顧性分析了105例肺炎克雷伯菌相關(guān)VAP患者?；颊叩钠骄挲g為(58±14)歲，其中男性77例，女性28例。上述患者分離出hvKP 26株，cKP 79株，其對(duì)應(yīng)VAP的臨床分析見表1。結(jié)果顯示hvKP患者與cKP患者相比，菌血癥發(fā)生率顯著升高(34.6%vs.3.8%)，病死率也明顯升高(53.8%vs.12.7%)。

表1 肺炎克雷伯菌呼吸機(jī)相關(guān)肺炎患者的臨床特征[例(%)]Table 1 Clinical characteristics of K.pneumoniae from mechanically ventilated patients[n(%)]

2.3 肺炎克雷伯菌的生物學(xué)特征分析

在分離出的肺炎克雷伯菌中，hvKP為26株(24.8%)，cKP為79株(75.2%)。結(jié)果進(jìn)一步顯示高黏液性表型與rmpA、aerobactin毒力基因呈高度相關(guān)性。26株hvKP中，88.5%(23/26)的菌株具有rmpA與aerobactin基因，并且rmpA與aerobactin基因同時(shí)存在于hvKP中。所有cKP菌株rmpA與aerobactin基因都呈陰性。hvKP中，血清型K1、K2所占的比例分別為15.4%(4/26)與26.9%(7/26)。cKP中沒有發(fā)現(xiàn)K1、K2血清型(表2)。

表2 肺炎克雷伯菌呼吸機(jī)相關(guān)肺炎病原分子特征[例(%)]Table 2 Microbiological characteristics of K.pneumoniae from mechanically ventilated patients[n(%)]

2.4 抗生素敏感性試驗(yàn)

結(jié)果顯示hvKP對(duì)常用抗生素的敏感性均明顯高于cKP(表3)。產(chǎn)ESBLs菌株檢出率49.5%(52/105)，其中產(chǎn)ESBLs的cKP比例(62.0%，49/79)顯著高于產(chǎn)ESBLs hvKP的比例(11.5%，3/26)。

表3 高黏液性肺炎克雷伯菌和經(jīng)典肺炎克雷伯菌對(duì)常用抗菌藥的敏感性[例(%)]Table 3 Difference of the antimicrobial susceptibility between hypermucoviscous and classic K.pneumoniae[n(%)]

在所有檢測(cè)菌株中只檢測(cè)出3株cKP對(duì)亞胺培南與美羅培南耐藥。

2.5 肺炎克雷伯菌MLST分型

MLST顯示105株臨床分離株共有24個(gè)ST型，hvKP與cKP沒有共同的ST型別，詳見使用PasteurMLST網(wǎng)站產(chǎn)生的最小生成樹分析(圖1)。26株hvKP共有11個(gè)ST型，表明其是多克隆傳播，但是從VAP患者呼吸道分離的5例hvKP屬于同一個(gè)ST型(ST23)，提示是克隆相關(guān)傳播。并且ST23在hvKP菌株中所占比例最高(19.2%，5/26)。79株cKP菌株鑒定出13種ST分型，同樣顯示其多克隆傳播。在cKP株中，主要流行株是ST11(24.1%，19/79)和ST15(22.8%，18/79)(表2)。

圖1 MLST基因型數(shù)據(jù)最小生成樹分析26株高黏液性肺炎克雷伯菌(A)與79株經(jīng)典肺炎克雷伯菌(B)(PasteurMLST網(wǎng)站分析)Fig.1 Minimum-spanning tree of 26 isolates of hypermucoviscous K.pneumonia (A)and classic K.pneumonia (B)(analysis at PasteurMLST website)

3 討論

HvKP是近年來發(fā)現(xiàn)的一種強(qiáng)致病力肺炎克雷伯菌的新型變種，主要引起社區(qū)獲得性感染，而在醫(yī)院感染中檢出率不高[5]。有報(bào)道稱hvKP主要在亞太地區(qū)流行，近年來播散至全球。hvKP造成的感染，包括肝膿腫、眼內(nèi)炎和嚴(yán)重的肺炎等，但關(guān)于hvKP相關(guān)VAP的研究和報(bào)道較少。本研究分析了105株肺炎克雷伯菌引起VAP患者的臨床特征及菌株的微生物學(xué)特征。我們發(fā)現(xiàn)VAP患者下呼吸道分離出hvKP 26株(24.8%，26/105)，cKP 79株(75.2%，79/105)。hvKP檢出比率高于之前報(bào)道的結(jié)果。本研究表明肺炎克雷伯菌相關(guān)VAP以cKP為主，但hvKP在VAP中的傳播比例在提高。

我們進(jìn)一步分析肺炎克雷伯菌VAP的臨床特征，結(jié)果顯示hvKP引起的呼吸機(jī)相關(guān)肺炎菌血癥的發(fā)生率顯著高于cKP引起的菌血癥(34.6%vs.3.8%，P<0.01)，并且hvKP病例組的病死率也高于經(jīng)典肺炎克雷伯病例組(53.8%vs.12.7%，P<0.01)。上述結(jié)果表明，在VAP中hvKP引起的感染嚴(yán)重，其致病性要高于cKP。

我們進(jìn)一步分析了hvKP與cKP之間毒力因子的差異。肺炎克雷伯菌毒力基因中，rmpA是細(xì)菌胞外莢膜多糖合成過程中重要的調(diào)節(jié)基因[10]，能夠促進(jìn)高黏液菌落表型的形成。hvKP胞外較厚的多糖莢膜，可以對(duì)抗白細(xì)胞吞噬作用，介導(dǎo)菌體抵抗宿主免疫殺傷，同時(shí)具有抗血清殺菌(補(bǔ)體系統(tǒng))的能力。aerobactin則可使細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)獲取宿主組織中的鐵以增強(qiáng)其存活能力。有研究報(bào)道，動(dòng)物模型中aerobactin可使肺炎克雷伯菌的毒力增加100倍[11]。研究發(fā)現(xiàn)rmpA基因位于一個(gè)180 kb大小的毒力相關(guān)質(zhì)粒上，該質(zhì)粒還含有其他毒力相關(guān)基因，包括aerobactin[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)hvKP中rmpA與aerobactin基因是協(xié)同存在于hvKP中，而cKP不含上述2種毒力基因，這使得hvKP的毒力要強(qiáng)于cKP。這種高毒力性也印證了上述臨床結(jié)果中hvKP引起的嚴(yán)重感染。K1和K2被認(rèn)為是hvKP的重要毒力血清型[13-14]。之前研究表明K1和K2型在醫(yī)院獲得性肺炎中的檢出比例(2/18，11%)低于社區(qū)獲得性肺炎中的檢出比例(23/49，47%)[12]。本研究結(jié)果同上述結(jié)論相似，我們也發(fā)現(xiàn)在VAP中分離的肺炎克雷伯菌中，K1和K2型的檢出率不高為10.5%(11/105)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中所有K1、K2型均為hvKP，cKP中無K1、K2型。同之前的報(bào)道hvKP很少引起院內(nèi)感染不同的是，本研究hvKP在院內(nèi)感染VAP中檢出比例為24.8%(26/105)。上述臨床結(jié)果提示非K1、K2血清型hvKP由社區(qū)獲得性感染正逐步向醫(yī)院獲得感染轉(zhuǎn)變。

有研究表明高黏液性菌株對(duì)抗生素耐藥比較少見[15]。然而，最近已有研究報(bào)道了多重耐藥高黏液性菌株引起的感染病例[16]。在本實(shí)驗(yàn)中hvKP對(duì)大多數(shù)抗生素的敏感性要高于cKP，但有3株高黏液性菌株產(chǎn)ESBLs。上述結(jié)果表明隨著高黏液性菌株在院內(nèi)感染中的持續(xù)存在，其可通過獲取耐藥基因成為高毒力合并高耐藥菌株。

在105例菌株中，一共鑒定出24種ST型。高黏液性菌株鑒定出11種ST型，該結(jié)果提示了在VAP中，高黏液性菌株是多克隆來源的。但有5例VAP患者分離出的高黏液性菌株為同一ST型別(ST23)，表明其是克隆相關(guān)感染。79例經(jīng)典菌株鑒定出13種ST型別，其中ST11型和ST15型最普遍，分別為ST11型19株，ST15型18株。高黏液性菌株和經(jīng)典菌株沒有共同的ST型別，表明這兩種類型的肺炎克雷伯菌具有不同的遺傳背景。

綜上所述，本研究分析了VAP患者下呼吸道肺炎克雷伯菌分離株的臨床及微生物學(xué)特征，與傳統(tǒng)觀點(diǎn)普遍認(rèn)為hvKP通常引起社區(qū)性感染不同的是，hvKP已經(jīng)成為院內(nèi)感染VAP的常見致病菌。而VAP患者感染hvKP后有較高的病死率且更容易并發(fā)菌血癥。隨著hvKP在醫(yī)院院內(nèi)感染的持續(xù)存在，其對(duì)抗生素的耐藥性也將提高。我們希望提醒醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科特別注意檢測(cè)肺炎克雷伯菌的黏液性狀、莢膜血清型和抗菌藥物敏感性，并及時(shí)與臨床溝通，從而幫助臨床醫(yī)師更迅速有效地控制高黏液性菌株引起的VAP。