AngⅡ?qū)ρ芷交〖?xì)胞ANO1表達(dá)的影響及機(jī)制

遲曉琦,李浩然,吳雪,張文秀,韓曉華

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東 青島 266071)

高血壓是一種以血壓持續(xù)升高為主要臨床表現(xiàn)的心血管疾病，具有很高的發(fā)病率和致殘率[1-3]。長(zhǎng)期的高血壓會(huì)導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，即血管重構(gòu)[4]，而后者是導(dǎo)致高血壓重要靶器官(如心、腦、腎等)損傷的關(guān)鍵病理生理學(xué)基礎(chǔ)[5]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)對(duì)心血管功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要活性成分，可以通過(guò)誘導(dǎo)血管收縮和外周血管阻力增加升高血壓；此外，AngⅡ?qū)ρ芷交〖?xì)胞(VSMCs)具有重要的調(diào)節(jié)作用，可通過(guò)促進(jìn)VSMCs的增殖、遷移和血管外基質(zhì)分泌等作用，促進(jìn)血管重構(gòu)的發(fā)生[7-8]。在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血漿和心血管組織中AngⅡ水平明顯升高，提示AngⅡ可能是促進(jìn)高血壓形成和發(fā)展的重要因素[9]。

ANO1是2008年發(fā)現(xiàn)的鈣激活氯通道，在心血管系統(tǒng)中有廣泛的表達(dá)[10-11]。ANO1參與血管舒縮功能的調(diào)節(jié)已有較多報(bào)道[12-14]，這可能是由于ANO1激活導(dǎo)致VSMCs內(nèi)Cl-外流和膜除極，進(jìn)而激活細(xì)胞膜電壓依從性鈣通道，觸發(fā)胞外鈣內(nèi)流和血管收縮，但是ANO1和血管重構(gòu)的關(guān)系報(bào)道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，ANO1參與了腎型高血壓大鼠大腦中動(dòng)脈血管重構(gòu)的形成[15]； ANO1能通過(guò)血管重構(gòu)促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓(PH)的形成[16]；在野百合堿和低氧誘導(dǎo)的大鼠PH模型中，ANO1被證實(shí)是肺動(dòng)脈VSMCs的鈣激活氯通道，且高表達(dá)的ANO1通過(guò)促進(jìn)血管收縮和血管重構(gòu)參與PH的形成[14]。WANG等[17]的研究結(jié)果表明，ANO1在SHR的血管組織和VSMCs中均呈高表達(dá)，并參與了SHR高血壓的形成，但是誘導(dǎo)ANO1高表達(dá)的因素并未被闡明。根據(jù)前期研究，我們推測(cè)AngⅡ可能通過(guò)促進(jìn)VSMCs的ANO1蛋白表達(dá)，參與對(duì)VSMCs功能調(diào)控。因此，本實(shí)驗(yàn)利用原代培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，觀察AngⅡ上調(diào)ANO1表達(dá)的量-效和時(shí)-效關(guān)系，并進(jìn)一步探討AngⅡ作用的受體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

AngⅡ、血管緊張素Ⅰ型受體(AT1R)阻斷劑氯沙坦鉀(LP)和血管緊張素Ⅱ型受體(AT2R)阻斷劑PD123319(PD)由ApexBio公司提供，ANO1抗體購(gòu)自Abcam公司，β-actin抗體購(gòu)自北京博奧森公司，DMEM高糖培養(yǎng)粉購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)BI公司，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo公司，RIPA裂解液由碧云天生物科技研究所提供，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)儀器包括CO2培養(yǎng)箱、無(wú)菌超凈工作臺(tái)、Eppendorf高速離心機(jī)、SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀、微量分析天平以及Western顯影儀等。

1.2 VSMCs的原代培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)選用體質(zhì)量80～100 g的Wistar大鼠，采用組織貼塊法進(jìn)行VSMCs的原代培養(yǎng)[18-20]。大鼠以80 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后，用體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇消毒，迅速剝離胸主動(dòng)脈，轉(zhuǎn)移到提前加入培養(yǎng)液的預(yù)冷玻璃皿中，清理血管內(nèi)的血液及血管外筋膜，輕輕刮去內(nèi)皮，將血管條剪成約1 mm3的小塊，鋪于培養(yǎng)瓶底部，加入含體積分?jǐn)?shù)0.20胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液4 mL，垂直放入CO2培養(yǎng)箱中，靜置4～5 h后翻瓶，培養(yǎng)約1周后VSMCs在血管塊周?chē)L(zhǎng)出，選5～8代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)1將VSMCs分為對(duì)照組(加入無(wú)血清培養(yǎng)液處理)和AngⅡ組(分別加入1、10、100、500、1 000 nmol/L AngⅡ)，處理24 h后觀察AngⅡ?qū)NO1蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)2分為對(duì)照組(加無(wú)血清培養(yǎng)液)和AngⅡ組(加入100 nmol/L AngⅡ)，觀察AngⅡ作用不同時(shí)間(1、6、12、24、48 h)對(duì)ANO1蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)3分為對(duì)照組(加無(wú)血清培養(yǎng)液)、AngⅡ組(加100 nmol/L AngⅡ作用24 h)、AngⅡ+LP組(AngⅡ處理前加入1 μmol/L LP)、AngⅡ+PD組(AngⅡ處理前加入1 μmol/L PD)，觀察AngⅡ受體阻斷劑對(duì)ANO1蛋白表達(dá)的影響。

1.4 Western blot檢測(cè)

藥物處理結(jié)束后以RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。樣品均以20 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加100 g/L脫脂奶粉在室溫下?lián)u床慢搖封閉60～120 min，分別加入ANO1(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)一抗，在4 ℃搖床上孵育過(guò)夜。用TBST洗膜3次后，加入二抗，在室溫下?lián)u床慢搖孵育1 h，TBST再洗膜3次后，用ECL發(fā)光液顯影。用Image J軟件分析條帶的灰度值，結(jié)果以ANO1/β-actin比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～4次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度AngⅡ?qū)NO1蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組ANO1蛋白表達(dá)水平為0.78±0.02，以1、10、100、500、1 000 nmol/L AngⅡ處理細(xì)胞24 h后，ANO1蛋白表達(dá)水平分別升高至0.85±0.05、0.92±0.03、1.14±0.10、0.95±0.02和0.91±0.02(n=3，F(xiàn)=18.56，P<0.01)。在各濃度組中，以10、100和500 nmol/L AngⅡ組的改變具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.866～12.820，P<0.01)，且以100 nmol/LAngⅡ作用最為顯著(圖1)。

Con為對(duì)照組；1、10、100、500、1 000分別表示AngⅡ的濃度為1、10、100、500、1 000 nmol/L。

2.2 AngⅡ作用不同時(shí)間對(duì)ANO1蛋白表達(dá)影響

對(duì)照組ANO1蛋白表達(dá)水平為1.00±0.09，以100 nmol/L AngⅡ處理1、6、12、24、48 h后，ANO1蛋白表達(dá)水平分別升高至1.05±0.17、1.28±0.30、1.65±0.28、1.82±0.14和1.58±0.12(n=4，F(xiàn)=10.84，P<0.01)，其中AngⅡ作用12、24和48 h后，ANO1蛋白的表達(dá)顯著增加(q=5.661～8.053，P<0.01)。見(jiàn)圖2。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用100 nmol/L的AngⅡ處理24 h進(jìn)行觀察。

Con為對(duì)照組；1、6、12、24、48分別示AngⅡ作用1、6、12、24、48 h。

2.3 AngⅡ受體阻斷劑對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的ANO1蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+LP組和AngⅡ+PD組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平分別為1.00±0.19、1.45±0.14、0.95±0.16和1.41±0.06(n=3，F(xiàn)=9.68，P<0.05)。與對(duì)照組相比，AngⅡ組ANO1蛋白表達(dá)水平升高(q=5.313，P<0.05)；與AngⅡ組相比，AngⅡ+LP組ANO1蛋白表達(dá)降低至對(duì)照組水平(q=5.872，P<0.05)，而AngⅡ+PD組ANO1蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯改變(q=0.452，P>0.05)。結(jié)果提示AT1R阻斷劑LP能夠完全阻斷AngⅡ誘導(dǎo)的ANO1蛋白表達(dá)，而AT2R阻斷劑PD則無(wú)此作用。見(jiàn)圖3。

Con為對(duì)照組。

3 討 論

AngⅡ是RAS的主要活性物質(zhì)[21]，也是公認(rèn)的誘導(dǎo)高血壓發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵致病因素。系統(tǒng)或血管局部生成的AngⅡ，不僅可以通過(guò)誘導(dǎo)血管平滑肌收縮和外周阻力增加升高血壓，還可以通過(guò)刺激VSMCs異常增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)形成，促進(jìn)高血壓血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展[8,22]。AngⅡ主要通過(guò)結(jié)合AT1R或AT2R發(fā)揮作用[23]。AngⅡ與AT1R結(jié)合后，可激活磷脂酶C(PLC)/三磷酸肌醇(IP3)信號(hào)通路，通過(guò)肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣釋放，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣水平升高，AngⅡ也可以激活A(yù)KT、ERK、RhoA/ROCK信號(hào)途徑以及升高胞內(nèi)活性氧(ROS)等多條途徑，參與對(duì)VSMCs的功能調(diào)控[24]。AngⅡ?qū)T2R的親和力較低，一般認(rèn)為AngⅡ與AT2R結(jié)合可拮抗其與AT1R結(jié)合所產(chǎn)生的效應(yīng)[25]。

ANO1是血管平滑肌上的鈣激活氯通道[26]，可參與血管功能和血壓的調(diào)節(jié)，并且和高血壓的血管重構(gòu)密切相關(guān)。一項(xiàng)針對(duì)SHR的研究表明，ANO1在血管組織和原代培養(yǎng)的VSMCs中均高表達(dá)，并且參與了SHR高血壓的形成[17]。由于SHR血循環(huán)和血管組織局部RAS過(guò)度激活已有報(bào)道[9]，且W?STEN-VAN ASPEREN等[27]研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ能夠增強(qiáng)ANO1依賴(lài)性鈣激活氯電流，因此我們推測(cè)AngⅡ很可能促進(jìn)了VSMCs中的ANO1蛋白表達(dá)，進(jìn)而參與AngⅡ?qū)SMCs的功能調(diào)控。

本研究首先利用組織貼塊法進(jìn)行VSMCs的原代培養(yǎng)，然后通過(guò)將不同濃度AngⅡ加入VSMCs作用不同時(shí)間，觀察AngⅡ?qū)NO1蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示，AngⅡ能夠明顯促進(jìn)VSMCs的ANO1表達(dá)，并且呈明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性。而通過(guò)利用特異性的血管緊張素受體阻斷劑，本研究進(jìn)一步明確了AngⅡ上調(diào)ANO1的作用是通過(guò)與AT1R結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。鈣激活氯通道ANO1是心血管領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，本研究通過(guò)探討AngⅡ?qū)SMCs中ANO1表達(dá)的影響及受體機(jī)制，為進(jìn)一步明確ANO1可能參與AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs功能異常提供了前期的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前，臨床上對(duì)高血壓血管重構(gòu)的預(yù)防和治療效果并不理想，而對(duì)ANO1的深入研究，可能為高血壓血管重構(gòu)的防治提供新的思路。