下調(diào)miR-141-3p對晚期NSCLC細胞侵襲轉(zhuǎn)移和化療敏感性影響及其機制

王亞飛,張振軍,宋長亮,張磊

(1 邯鄲市中心醫(yī)院腫瘤科,河北 邯鄲 056000; 2 冀中能源峰峰集團總醫(yī)院邯鄲分院骨科)

肺癌病死率位居惡性腫瘤的首位，多數(shù)病人確診時已是晚期失去手術(shù)機會，其預(yù)后極差，多歸因于目前缺乏有效的早期診斷途徑[1-4]。晚期非小細胞肺癌(NSCLC)病人多采用以化療為主的治療方案[5-6]。值得注意的是腫瘤治療效果與病人個體化特征密切相關(guān)，即便同一種治療方案應(yīng)用于有著相似臨床診斷、臨床分期及藥物種類和劑量的不同患癌個體，亦可能產(chǎn)生不同反應(yīng)?；熋舾行砸殉蔀楹饬炕熜Ч闹饕笜?biāo)[4]，而耐藥性在治療過程中很常見。微小RNA(microRNA)是一類非編碼RNA，可通過調(diào)節(jié)特定基因的表達，參與腫瘤發(fā)展進程[7]。近年來的研究表明，microRNA在肺癌的發(fā)展、診療、放化療敏感性等方面均發(fā)揮著重要作用[8-9]。例如，miR-141已被證實可作為NSCLC潛在的診斷標(biāo)志物[10-11]；miR-141-3p在對化療有效的NSCLC病人中呈低表達[12]。但目前關(guān)于miR-141-3p是否參與晚期NSCLC治療過程中化療敏感性機制的研究未見報道。本研究以體外實驗方式，采用細胞轉(zhuǎn)染探究miR-141-3p在NSCLC細胞系的表達，并探討其對晚期NSCLC化療敏感性的影響及其作用機制，為逆轉(zhuǎn)肺癌化療耐藥性提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1試劑和儀器 NSCLC細胞株A549(中國科學(xué)院腫瘤研究所)；順鉑(北京沃凱生物科技有限公司)；miR-141-3p模擬物(miR-141-3p mimic)、miR-141-3p抑制物(miR-141-3p inhibitor)、Yes相關(guān)蛋白1載體(YAP1vector)、YAP1沉默表達(siRNA-YAP1)質(zhì)粒和PCR引物(上海吉瑪公司)；Matrigel膠(上海玉博生物科技有限公司)；倒置顯微鏡(Leica公司，德國)；CCK8試劑(上海翊圣生物科技有限公司)；Trizol試劑(北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司)；兩步法實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；Western blot抗體(Abcam，UK)；ECL發(fā)光液(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(翌圣生物科技(上海)有限公司)。

1.1.2研究對象 2016年6月—2018年6月，選擇邯鄲市中心醫(yī)院不能手術(shù)的50例晚期NSCLC病人作為研究對象，術(shù)前均未接受放化療及免疫治療。其中男34例，女16例，年齡為22～71歲，平均年齡(54.12±6.67)歲。所有病例均經(jīng)CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺或支氣管鏡下黏膜活檢，并經(jīng)病理證實為晚期NSCLC。同時，以24例手術(shù)切除的肺癌病人的癌旁正常肺組織(距病灶5 cm)為對照組。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組處理 收集NSCLC細胞株A549置于Kaighn’s F-12K培養(yǎng)基(補加有體積分數(shù)0.10胎牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素/真菌素)，接種于24孔板，每孔500 μL，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中孵育。根據(jù)細胞生長情況，每隔2～3 d傳代1次。將細胞分為6組：Blank組(A組，不做任何處理)，miR-141-3p mimic組(B組，轉(zhuǎn)染miR-141-3p過表達質(zhì)粒)，miR-141-3p inhibitor組(C組，轉(zhuǎn)染miR-141-3p inhibitor質(zhì)粒)，YAP1vector組(D組，轉(zhuǎn)染YAP1過表達質(zhì)粒)，siRNA-YAP1組(E組，轉(zhuǎn)染siRNA-YAP1質(zhì)粒)，miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組(F組，共轉(zhuǎn)染miR-141-3p inhibitor質(zhì)粒和YAP1過表達質(zhì)粒)。均采用Lipofectamine Transfection Reagent 2000(Invitrogen)介導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)染。

1.2.2qRT-PCR檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞，Trizol法提取細胞總RNA，并測定濃度和純度(組織檢測步驟同細胞檢測)。按照qRT-PCR試劑盒說明書操作，置于PCR擴增儀，將樣品RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，并進行qRT-PCR擴增。將基因上下游引物稀釋，加入PCR擴增體系，滅菌ddH2O補足至20 μL。目的基因以GADPH為內(nèi)參照，使用實時PCR檢測系統(tǒng)平臺進行檢測。取Ct值，采用相對定量法計算，用2-△△Ct表示各目的基因相對表達量。每個實驗均重復(fù)3次，取其均值。

1.2.3雙熒光素酶報告檢測 使用生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站進行miR-141-3p和YAP1的結(jié)合位點分析?？寺U增YAP1的3’UTR區(qū)到pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體上，并命名為pWt-YAP1。同時構(gòu)建pMut-YAP1載體，mimic-NC組與miR-141-3p mimic組分別與熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染NSCLC細胞株A549，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強度。

1.2.4Transwell實驗 在各組轉(zhuǎn)染48 h后細胞板內(nèi)，每孔上室加200 μL細胞懸液，下室加800 μL含有體積分數(shù)0.20 FBS的條件培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱孵育20～24 h。取出Transwell板，1 g/L甲紫溶液染色。晾干后用倒置顯微鏡隨機計數(shù)5個視野的細胞，并取平均值。實驗重復(fù)3次。

1.2.5劃痕實驗 用Marker筆在6孔板背后均勻畫橫線(間距0.5～1.0 cm)，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。加入各組轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，過夜培養(yǎng)，待細胞均勻鋪滿容器底面。次日用槍頭沿直尺劃痕。用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取樣拍照。

1.2.6CCK8檢測 使用體積分數(shù)0.10 FBS培養(yǎng)基配制成不同濃度的順鉑溶液，4 ℃儲存?zhèn)溆?。取對?shù)生長期的細胞接種于96孔培養(yǎng)板，置37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng)，取10 mg/L順鉑，加入96孔板中，設(shè)3個復(fù)孔。設(shè)置空白對照。48 h后，每孔加新配制的CCK8試劑10 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸去培養(yǎng)液。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔450 nm波長處吸光度(A)。細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.7Western blot檢測 收集轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后的各組細胞，以PBS洗滌后重懸。離心取上清，加入RIPA裂解液，輕搖重懸后，冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，即為細胞總蛋白。應(yīng)用碧云天BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取20 μg細胞總蛋白用100 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，隨后濕法轉(zhuǎn)膜，使用50 g/L的脫脂奶粉封閉1.5 h。按照抗體說明書稀釋相應(yīng)抗體于一抗稀釋液中。實驗所用的一抗如下：一抗兔抗人YAP1、一抗兔抗人TGF-β、一抗兔抗人Smad2及一抗兔抗人GAPDH多克隆抗體。加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG抗體，在室溫下反應(yīng)2 h，ECL發(fā)光液顯色，并曝光成像。采用Quanity One軟件進行蛋白條帶灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 晚期NSCLC組織miR-141-3p和YAP1表達

通過對50例晚期NSCLC組織及24例癌旁組織的qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，癌組織中miR-141-3p和YAP1表達均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=23.19、17.32，P均<0.05)。見圖1。

①miR-141-3p，②YAP1。與癌旁組織相比，*P<0.05。

2.2 miR-141-3p對YAP1基因表達的調(diào)控

為研究miR-141-3p在NSCLC細胞中的靶向關(guān)系，通過生物學(xué)網(wǎng)站對其進行分析，結(jié)果顯示，miR-141-3p和YAP1存在結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因預(yù)測結(jié)果顯示，與mimic-NC組相比較，YAP1野生型3’UTR的熒光素酶活性能被miR-141-3p抑制(t=7.643，P<0.05)，而對YAP1突變型3’UTR的熒光素酶活性沒有影響(P>0.05)。說明miR-141-3p能特異性結(jié)合YAP1的3’UTR區(qū)并在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)FANCM基因表達。見圖2。

①生物學(xué)網(wǎng)站預(yù)測miR-141-3p和YAP1的結(jié)合位點；②miR-141-3p和YAP1的熒光素酶活性檢測結(jié)果。與mimic-NC組相比較，*P<0.05。

2.3 miR-141-3p調(diào)控對各組細胞YAP1表達影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，各組細胞YAP1表達差異有顯著意義(F=116.8，P<0.05)。與Blank組相比，miR-141-3p mimic組YAP1基因表達上升(Tukey’s檢驗，P<0.05)，miR-141-3p inhibitor組YAP1基因表達下降(Tukey’s檢驗，P<0.05)。說明miR-141-3p表達能夠調(diào)控YAP1表達。見圖3。

A：Blank組，B：miR-141-3p mimic組，C：miR-141-3p inhibitor組，D：YAP1 vector組，E：siRNA-YAP1組，F(xiàn)：miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組。與Blank組相比，*P<0.05。

2.4 miR-141-3p對晚期NSCLC細胞的增殖、遷移和耐藥性的影響

結(jié)果顯示，各組NSCLC細胞的增殖、遷移和耐藥性比較，差異有顯著意義(F=82.670～181.000，P均<0.05)。與Blank組相比，miR-141-3p mimic組和YAP1vector組癌細胞侵襲、遷移能力明顯增強，順鉑處理后細胞存活率明顯增加，差異有顯著意義(Tukey’s檢驗，P均<0.05)；而miR-141-3p inhibitor組和siRNA-YAP1組癌細胞侵襲、遷移能力明顯減弱，順鉑處理后細胞存活率明顯降低，差異有顯著性(Tukey’s檢驗，P均<0.05)。Blank組和miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組各指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。說明miR-141-3p inhibitor+pcDNA-YAP1組逆轉(zhuǎn)了這一趨勢。見圖4、5。

①各組細胞侵襲情況；②各組細胞侵襲率。A：Blank組，B：miR-141-3p mimic組，C：miR-141-3p inhibitor組，D：YAP1 vector組，E：siRNA-YAP1組，F(xiàn)：miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組。與Blank組相比，*P<0.05。

①各組細胞遷移情況；②各組細胞遷移數(shù)。A：Blank組，B：miR-141-3p mimic組，C：miR-141-3p inhibitor組，D：YAP1 vector組，E：siRNA-YAP1組，F(xiàn)：miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組。與Blank組相比，*P<0.05。

2.5 miR-141-3p對TGF-β信號通路相關(guān)蛋白影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，各組TGF-β信號通路相關(guān)蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=159.800、125.3000，P均<0.05)。與Blank組相比，miR-141-3p mimic組和YAP1vector組TGF-β和Smad2表達水平明顯下降，而miR-141-3p inhibitor組和siRNA-YAP1組TGF-β表達水平明顯提高，差異有顯著性(Tukey’s檢驗，P均<0.05)。Blank組和miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組各項指標(biāo)差異無顯著性(均P>0.05)。見圖6。

①各組蛋白電泳圖；②各組蛋白表達量。A：Blank組，B：miR-141-3p mimic組，C：miR-141-3p inhibitor組，D：YAP1 vector組，E：siRNA-YAP1組，F(xiàn)：miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組。與Blank組相比，*P<0.05。

3 討 論

microRNA已被證實在人類腫瘤的抗放化療機制中發(fā)揮重要作用。例如，LIU等[13]在其研究中利用microRNA分子譜分析法篩選與LASS2相關(guān)的microRNA，以為鑒別化療耐藥和化療敏感性提供依據(jù)，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-93抑制劑可增強si-LASS2轉(zhuǎn)染腫瘤細胞的化學(xué)敏感性。LANG等[14]報道，采用miR-24靶向沉默S100A8基因可提高子宮內(nèi)膜癌細胞對紫杉醇的化療敏感性。劉娜等[15]在其研究中利用慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞株，構(gòu)建miR-200a表達上調(diào)模型，并結(jié)合MTT實驗、PCR和免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)miR-200a可能通過調(diào)控耐藥相關(guān)ABC家族基因如ABCB3、ABCC1、ABCC2、ABCC3和ABCG2的表達，增加卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性。肖悅等[16]通過構(gòu)建穩(wěn)定表達miR-18a的白血病細胞轉(zhuǎn)染模型，發(fā)現(xiàn)miR-18a能夠通過靶定ATM調(diào)節(jié)白血病細胞HL-60對VP-16和VCR化療敏感性。鑒于microRNA能在基因編碼水平上反映腫瘤的耐藥性機制[17-19]，那么通過構(gòu)建特定表達干預(yù)的細胞轉(zhuǎn)染模型，可有助于探究特定microRNA與腫瘤耐藥性的關(guān)聯(lián)及其作用機制。

在本研究前期，我們通過生物信息學(xué)方法篩選出晚期NSCLC過表達基因miR-141-3p，且在線生物學(xué)預(yù)測軟件報道m(xù)iR-141-3p調(diào)控YAP1，YAP1在晚期NSCLC亦高表達，因此推測miR-141-3p通過調(diào)控YAP1影響晚期NSCLC。本研究首先通過qRT-PCR驗證組織中miR-141-3p和YAP1的表達。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，晚期NSCLC中miR-141-3p和YAP1呈高表達。進而，我們通過細胞轉(zhuǎn)染分為不同干預(yù)組別，探討了miR-141-3p對YAP1的調(diào)控關(guān)系，結(jié)果顯示，過表達miR-141-3p能夠促進YAP1基因和蛋白的表達，沉默miR-141-3p能夠抑制YAP1基因和蛋白的表達，說明miR-141-3p的表達能夠調(diào)控YAP1的表達。進一步研究結(jié)果表明，通過轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimic或YAP1vector，相比Blank組，過表達miR-141-3p或YAP1能夠抑制TGF-β和Smad2表達，促進癌細胞侵襲遷移，增加細胞對順鉑耐藥性。而通過miR-141-3pinhibitor或si-YAP1轉(zhuǎn)染處理，則顯示沉默miR-141-3p或YAP1能夠提高TGF-β和Smad2表達，抑制癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲，降低細胞對順鉑耐藥性。與此同時，Blank組和miR-141-3p mimic+siRNA-YAP1組各項指標(biāo)無顯著差異，提示后者逆轉(zhuǎn)了這種趨勢。這說明miR-141-3p能夠通過YAP1促進晚期NSCLC細胞的增殖、遷移和耐藥。

基于以上實驗探究，我們推測，miR-141-3p下調(diào)可能通過抑制YAP1基因表達，激活TGF-β信號通路，進而調(diào)控晚期NSCLC細胞侵襲轉(zhuǎn)移和化療敏感性。值得注意的是，TGF-β家族是一類功能復(fù)雜的細胞因子，可廣泛參與各種病理生理過程，介導(dǎo)腫瘤細胞的分化與增殖[20-22]。TGF-β信號通路相關(guān)蛋白如Smad2，亦參與人類腫瘤進程，與乳癌、肺癌等發(fā)生發(fā)展相關(guān)[23-24]。TGF-β信號通路及其相關(guān)蛋白組成腫瘤抑制通路，介導(dǎo)腫瘤細胞生長，并且可激活一系列信號通路如MAPK、ERK等信號通路[25-26]。本研究中，miR-141-3p下調(diào)及YAP1基因表達抑制促進了TGF-β和Smad2表達的提升，進而激活TGF-β信號通路，對于降低順鉑耐藥性具有重要作用。既往研究已報道TGF-β信號通路與化療耐藥有關(guān)，并可通過調(diào)控TGF-β信號通路抑制腫瘤耐藥[27]。孫彩霞等[28]報道，轉(zhuǎn)染miR-141模擬物可降低卵巢癌細胞株SKOV-3和ES-2細胞對卡鉑的敏感性，提示檢測miR-141表達水平在預(yù)測卵巢癌對卡鉑敏感性、評估病人預(yù)后及其合理指導(dǎo)綜合治療等方面的臨床意義。

綜上所述，本文結(jié)果顯示，miR-141-3p下調(diào)可能通過抑制YAP1基因表達，激活TGF-β信號通路，進而調(diào)控晚期NSCLC細胞侵襲轉(zhuǎn)移和化療敏感性。本研究可為人類探討NSCLC耐藥機制提供新途徑，microRNA與NSCLC耐藥間的相關(guān)性將為逆轉(zhuǎn)其耐藥性提供一種全新的思路和策略。然而，本研究僅在細胞實驗中初步探究miR-141-3p對NSCLC影響的作用機制，是否存在其他潛在靶點及其作用機制均未可知，其將為今后研究的主要方向，進而為NSCLC的診治提供分子生物學(xué)依據(jù)。