劉新鋒

(駐馬店市中心醫(yī)院心血管內(nèi)一科,河南 駐馬店 463000)

冠心病是由動(dòng)脈粥樣硬化(AS)引起的心腦血管疾病，嚴(yán)重影響人類的健康和生命[1]。業(yè)已證實(shí)，冠心病是一種慢性炎癥性疾病[2]。有證據(jù)表明，血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖和凋亡失衡是AS發(fā)展的關(guān)鍵步驟[3]。蛋白去乙?；?(HDAC9)屬于HDAC家族成員，HDAC9參與心血管疾病發(fā)生和發(fā)展[4-6]。而人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HCASMC)在外界因子刺激下增殖和凋亡能夠參與AS的發(fā)病過(guò)程[7]。目前，有關(guān)HDAC9基因與HCASMC關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。因此，本文探究HDAC9基因?qū)χ嗵?LPS)誘導(dǎo)HCASMC增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響，以期為冠心病的治療提供新的靶點(diǎn)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HCASMC)購(gòu)自美國(guó)Lifeline公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；二甲基亞砜購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR premix Ex Taq PCR Kit熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；HDAC9siRNA及陰性對(duì)照(siRNA Control)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒及Western blot檢測(cè)所需試劑均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；HDAC9抗體、β-actin抗體及辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HCASMC復(fù)蘇后接種到含有體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，將其放置于體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換1次新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合度達(dá)到90%時(shí)，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，按照1∶3進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCASMC進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞處理和實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCASMC以胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞單層融合時(shí)進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組(A組，未做處理)，模型組(B組，以1 mg/L的LPS處理48 h)，陰性對(duì)照組(C組，轉(zhuǎn)染siRNA Control后以1 mg/L的LPS處理48 h)，轉(zhuǎn)染組(D組，轉(zhuǎn)染HDAC9siRNA后以1 mg/L的LPS處理48 h)。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行，LPS處理HCASMC的濃度和時(shí)間參考文獻(xiàn)方法[8-9]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組細(xì)胞處理48 h后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)HDAC9mRNA表達(dá)水平 采用Trizol試劑分別提取各組HCASMC中總RNA，以RNA為模板使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，再以cDNA為模板使用SYBR premix Ex Taq PCR Kit檢測(cè)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系包括：cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR 10 μL，ddH2O 6 μL，避光加樣。短暫離心后放置在熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)置為：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，共設(shè)40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，用相對(duì)定量2-△△CT法計(jì)算HDAC9mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4Western blot檢測(cè)HDAC9蛋白的表達(dá)水平收集各組處理48 h后HCASMC，加入適量細(xì)胞裂解液，置冰上裂解并提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取40 μg蛋白樣品進(jìn)行加樣，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，在含50 g/L脫脂奶粉的封閉液中孵育2 h，分別加入1∶500稀釋的HDAC9一抗，4 ℃過(guò)夜雜交，再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光方法顯影和定影后，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-actin進(jìn)行標(biāo)定，采用Image J軟件對(duì)各條帶灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算各組HCASMC中HDAC9蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCASMC接種到96孔板中，按照上述1.2.2方法分組和處理，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，48 h后向各孔細(xì)胞中分別添加20 μL 的MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出96孔板，棄上清液，再向細(xì)胞中加入150 μL二甲基亞砜，放置在震蕩儀上低速振蕩10 min，待還原物充分溶解以后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A值)。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 處理48 h后各組HCASMC加入胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，首先加入Annexin V-FITC重懸細(xì)胞，然后加入PI染液，輕輕混勻，室溫下避光孵育10 min，隨機(jī)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8的含量 各組HCASMC處理48 h后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照TNF-α、IL-1β和IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 LPS誘導(dǎo)HCASMC中HDAC9的表達(dá)

qRT-PCR和Western blot方法分別檢測(cè)各組HCASMC中HDAC9的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中HDAC9mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(F=91.145、185.108，q=19.403、25.646，P<0.05)；與模型組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中HDAC9mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(q=13.393～20.714,P<0.05)；而模型組和陰性對(duì)照組兩組相比，細(xì)胞中HDAC9的mRNA和蛋白表達(dá)水平均無(wú)明顯變化(P均>0.05)。提示LPS能夠誘導(dǎo)HCASMC中HDAC9的表達(dá)，轉(zhuǎn)染HDAC9siRNA能夠成功敲低HCASMC中HDAC9的表達(dá)。見(jiàn)圖1和表1。

A：空白對(duì)照組，B：模型組，C：陰性對(duì)照組，D：轉(zhuǎn)染組。

表1 各組HCASMC中HDAC9 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

2.2 敲低HDAC9表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)HCASMC活力的影響

MTT檢測(cè)的結(jié)果表明，空白對(duì)照組、模型組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的A值分別為0.35±0.03、0.56±0.04、0.55±0.04和0.41±0.03。與空白對(duì)照組相比，模型組HCASMC 的A值明顯升高(F=77.940，q=17.819，P<0.05)；與模型組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組HCASMC的A值明顯降低(q=12.728、11.879，P<0.05)；而模型組和陰性對(duì)照組相比，HCASMC的A值無(wú)明顯改變(P>0.05)。提示LPS能夠提高HCASMC活力，敲低HDAC9基因表達(dá)能夠抑制LPS誘導(dǎo)的HCASMC活力增加。

2.3 敲低HDAC9表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)HCASMC凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，空白對(duì)照組、模型組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組HCASMC凋亡率分別為(6.64±0.74)%、(2.37±0.26)%、(2.56±0.28)%和(7.61±1.42)%。與空白對(duì)照組細(xì)胞相比較，模型組HCASMC凋亡率明顯降低(F=98.321，q=15.563，P<0.05)；與模型組和陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染組HCASMC凋亡率明顯升高(q=19.098、18.406，P<0.05)；而模型組和陰性對(duì)照組相比較，HCASMC的凋亡率無(wú)顯著變化(P>0.05)。提示LPS可阻礙HCASMC凋亡，而敲低HDAC9基因表達(dá)能促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的HCASMC凋亡。見(jiàn)圖2。

A：空白對(duì)照組，B：模型組，C：陰性對(duì)照組，D：轉(zhuǎn)染組。

2.4 敲低HDAC9基因表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子分泌的影響

ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8的含量顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量明顯升高(F=91.145～325.808，q=10.813～15.180，P<0.05)；與模型組和陰性對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量均明顯降低(q=7.826～8.941，P<0.05)；而模型組和陰性對(duì)照組相比，上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量無(wú)明顯變化(P>0.05)。提示LPS可誘導(dǎo)HCASMC分泌炎癥因子，而敲低HDAC9基因表達(dá)能夠抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8含量比較

3 討 論

冠心病是一種慢性炎癥性疾病。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞、VSMCs和炎癥細(xì)胞參與冠心病的病理過(guò)程[10-15]。VSMCs的增殖失控及凋亡抑制在內(nèi)膜增厚過(guò)程中起重要作用，是冠心病的重要致病機(jī)制。大量研究結(jié)果已證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程[16-20]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取HCASMC為載體，以探究冠心病的發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)的研究結(jié)果已顯示，體外VSMCs增殖受多種生長(zhǎng)因子的刺激，如血管緊張素Ⅱ、氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、脂多糖(LPS)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF)-β和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等[21-25]。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合以往研究以LPS誘導(dǎo)HCASMC進(jìn)行造模，以探究HDAC9基因?qū)PS誘導(dǎo)HCASMC增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)影響。本文研究結(jié)果顯示，LPS能夠上調(diào)HCASMC活力，抑制HCASMC凋亡，促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8等分泌誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，這些結(jié)果與以往研究一致。此外，LPS能夠上調(diào)HCASMC中HDAC9基因的表達(dá)。

HDAC9基因位于染色體7p21上，該基因?qū)儆贖DAC家族，在心肌、骨骼肌、胎盤等組織中均有表達(dá)。靳洲等[26]報(bào)道，HDAC9通過(guò)促進(jìn)AS在大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死中發(fā)揮重要作用。成海鵬[27]的研究結(jié)果顯示，沉默HDAC9基因能夠促進(jìn)炎癥因子分泌及巨噬細(xì)胞脂質(zhì)的累積。多項(xiàng)研究表明，HDAC9基因多態(tài)性與冠心病、AS和缺血性卒中等密切相關(guān)[28-29]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染特異性HDAC9siRNA敲低LPS誘導(dǎo)的HCASMC中HDAC9的表達(dá)，結(jié)果顯示，敲低HDAC9能夠部分逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的HCASMC活力升高及凋亡下調(diào)。炎癥反應(yīng)的激活能夠改變內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs生物學(xué)行為，炎癥因子可以募集更多的炎性細(xì)胞以促進(jìn)AS病變的形成[30-32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低HDAC9基因可抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8分泌，降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。提示HDAC9能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)的激活抑制動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)生和進(jìn)展，但其具體作用機(jī)制仍需深入探究。

綜上所述，敲低HDAC9基因能夠抑制LPS誘導(dǎo)的HCASMC增殖及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)HCASMC凋亡。隨著對(duì)HDAC9基因研究的深入，相信其可能成為動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病治療新的分子靶向，但HDAC9在動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病中的作用機(jī)制目前尚不十分明確，有待進(jìn)一步深入探究。此外，本實(shí)驗(yàn)未在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行探究尚顯不足，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)此補(bǔ)充和驗(yàn)證。