柱前衍生-高效液相色譜法測定酒中的氰化物

何維為，徐燦輝，何 超，孫詩程

（益陽市食品藥品檢驗所，湖南 益陽 413000）

氰化物是指帶有氰基的化合物，可分為無機氰化物和有機氰化物，凡能在熱或與酸作用后在空氣中或組織中釋放出氰離子或氫氰酸的均有劇烈毒性。氰化物通常以氰苷配糖體的形式廣泛存在于多種植物中。據(jù)統(tǒng)計，含氰化物的植物超過2000種，其中果核類有1000余種，如木薯、高粱、小麥、玉米、楊梅、亞麻籽、葡萄籽等[1-2]。如果采用含氰化物的植物為原料制酒，產(chǎn)品中可能帶入氰化物，一旦超出限量即可危害人體健康，造成公共安全事件[3-4]。目前，國家安全標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定白酒中的氰化物含量限度為≤0.8 mg/L[5]。測定方法主要是國家標(biāo)準(zhǔn)[6]第一法：異煙酸-吡唑啉酮分光光度法。然而，此法對反應(yīng)體系的pH值要求較嚴(yán)（6.7～6.9），在實際操作時，常因反復(fù)調(diào)節(jié)pH值使溶液總體積超出標(biāo)準(zhǔn)限度，導(dǎo)致回收率低甚至試驗失?。挥幸恍┏吻宓木祁惣尤腼@色劑后也會產(chǎn)生輕微渾濁，影響吸光度測定[7-8]。因此，化學(xué)滴定法、連續(xù)流動分析儀測定法、離子色譜法、頂空氣相色譜法、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法等也被廣泛研究[9-13]，但高效液相色譜法未見研究報道。本文通過采用異煙酸-巴比妥酸柱前衍生，建立酒中氰化物的高效液相色譜測定法，檢測白酒、啤酒、葡萄酒等不同種類的酒中氰化物，獲得了滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫）；甲醇，乙腈（色譜純，Honeywell）；水中氰標(biāo)準(zhǔn)溶液[來源：中國計量科學(xué)研究院 GBW（E）080115，批號：19045，濃度：50.0 mg/L]；異煙酸（分析純，國藥集團）；巴比妥酸（分析純，國藥集團）；氯胺T（分析純，國藥集團）；水為超純水。樣品均由市場購得。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，菲羅門），流動相：1 %乙酸-乙腈（50:50）。檢測波長600 nm，流速1.0 ml/min；柱箱溫度25 ℃；進樣體積20 μl。

1.2.2 溶液制備 磷酸鹽緩沖液（pH 5.0）：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）17.9 g，加水溶解，并稀釋至100 ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.0，即得。

異煙酸-巴比妥酸試液：稱取異煙酸2.0 g和巴比妥酸1.0 g，加到100 ml 60～70 ℃的12 g/L氫氧化鈉溶液中，攪拌溶解，冷卻后加水至100 ml，即得。

氯胺T溶液：稱取氯胺T1.0 g，加水100 ml，攪拌溶解，即得。

白酒樣品溶液：吸取1.0 ml試樣，置入50 ml燒杯，加入2 g/L氫氧化鈉溶液5 ml，放置10 min，然后放于120 ℃電加熱板上加熱至溶液剩余約1 ml，取下放至室溫，用2 g/L氫氧化鈉溶液轉(zhuǎn)移至25 ml具塞比色管中，最后加2 g/L氫氧化鈉至10 ml。

有色酒樣品溶液：取25.0 ml試樣于250 ml蒸餾瓶中，加入100 ml水，滴加甲基橙指示劑數(shù)滴，將冷凝管下端插入盛有2 g/L氫氧化鈉溶液的10 ml比色管液面下，再加入1.5 g酒石酸，迅速連接蒸餾裝置進行水蒸氣蒸餾，收集蒸餾液約50 ml，然后用水定容至 50 ml，混合均勻。取餾出液2.0 ml，按白酒樣品溶液制備方法制備。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：精密吸取水中氰標(biāo)準(zhǔn)溶液（50.0 mg/L）2.00 ml，置入100 ml量瓶中，加水稀釋至刻度（1.0 mg/L），再分別精密吸取稀釋溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 ml于25 ml具塞比色管中，加 2 g/L氫氧化鈉至10 ml。

空白溶液：用水25.0 ml作為樣品，照有色酒樣品溶液制備方法制備。

加標(biāo)樣品溶液：取按本文方法測定結(jié)果為未檢出的樣品（見表2干紅葡萄酒）25.0 ml，精密加入1.0 mg/L氰標(biāo)準(zhǔn)溶液，按有色酒樣品溶液制備方法制備。

1.2.3 測定法 取樣品溶液和系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入2滴酚酞指示劑，然后逐滴加入3 %乙酸溶液調(diào)至紅色剛好褪去，加磷酸鹽緩沖液（pH 5.0）3.0 ml，再加入氯胺T溶液0.25 ml，搖勻，放置3 min，加入異煙酸-巴比妥酸試液5.0 ml，加水稀釋至 25 ml，密塞，25 ℃恒溫水浴鍋中放置15 min，用0.45 μm濾膜過濾。取續(xù)濾液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積外標(biāo)法計算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)研究

2.1.1 異煙酸-巴比妥酸試液的用量 吸取氰標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/L）1.00 ml于25 ml具塞比色管中，加 2 g/L氫氧化鈉至10 ml，按1.2.3 項方法，通過測定加入不同體積異煙酸-巴比妥酸試液反應(yīng)的衍生物峰面積變化，考察衍生試劑用量的影響。如圖1所示，隨著試劑用量增加，峰面積增大，在加入量5.0 ml時達(dá)到穩(wěn)定。

圖1 衍生劑加入量對峰面積的影響

2.1.2 反應(yīng)體系酸堿度 吸取氰標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/L）1.00 ml于25 ml具塞比色管中，加 2 g/L氫氧化鈉至10 ml，按1.2.3項方法，通過分別加入不同pH值的磷酸鹽緩沖液3 ml控制反應(yīng)體系酸堿度，測定其衍生物峰面積變化來考察酸堿度對反應(yīng)的影響。如圖2所示，反應(yīng)體系在pH 5.0～6.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，加入pH 5.0磷酸鹽緩沖液時峰面積最大。

圖2 pH值對峰面積的影響

2.1.3 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間 吸取氰標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/L）1.00 ml于25 ml具塞比色管中，加 2 g/L氫氧化鈉至10 ml，按1.2.3 項方法，通過測定改變反應(yīng)時間和溫度條件下衍生物的峰面積變化考察反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的影響，結(jié)果表明，反應(yīng)體系超過30 ℃時峰面積明顯降低，低于20 ℃反應(yīng)速率降低，反應(yīng)時間長且反應(yīng)不完全，采用25 ℃反應(yīng)15 min即可達(dá)到穩(wěn)定。

2.1.4 檢測波長確定 吸取氰標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/L）1.00 ml于25 ml具塞比色管中，加 2 g/L氫氧化鈉至10 ml，按1.2.3項方法衍生顯色，在200～800 nm范圍內(nèi)進行紫外-可見吸收光譜掃描，溶液在600 nm和250 nm有最大吸收，250 nm吸光度雖更強，但屬于紫外吸收區(qū)，干擾因素多，故選取專屬性強的600 nm為檢測波長。

2.1.5 流動相選擇 本文分別考察水與甲醇、水與乙腈、1 %乙酸與甲醇、1 %乙酸與乙腈作為流動相的分離效果。結(jié)果表明，水與甲醇作為流動相時色譜峰出現(xiàn)雙峰，水與乙腈作為流動相時色譜峰拖尾嚴(yán)重，1 %乙酸與甲醇作為流動相時呈現(xiàn)“饅頭峰”，1 %乙酸與乙腈作為流動相時峰對稱性好、理論板數(shù)高。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 專屬性 取空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、陰性樣品溶液（未檢出）、加標(biāo)樣品溶液分別注入色譜儀，記錄色譜圖（見圖3）。結(jié)果表明：空白溶液在標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜主峰的保留時間無色譜峰，樣品溶液中無干擾目標(biāo)物檢測的色譜峰。

圖3 專屬性試驗色譜圖

2.2.2 線性和范圍 取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得線性回歸方程：Y=6.1885X+0.4019，r2=0.9998，在0.5～40.0 μg/L范圍內(nèi)目標(biāo)物濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度 取加標(biāo)樣品溶液（約含氰化物20.0 μg/L）連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，峰面積分別為：124.035，123.158，124.593，123.268，123.997，124.691，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.41 %，表明本法精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性 取加標(biāo)樣品溶液（約含氰化物20.0 μg/L）每隔1 h進樣1次，共8次，記錄色譜圖，峰面積分別為：123.614，124.635，125.158，122.589，124.156，122.463，123.561，121.653，RSD為0.76 %，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 檢出限 通過逐漸減小氰標(biāo)準(zhǔn)溶液加入體積來制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3項方法衍生并取濾液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以S/N=3計算，檢出限為0.5 μg/L。

2.2.6 加標(biāo)回收率 取按2.2.7項測定氰化物含量的3種類型的樣品，分別加入一定體積的氰標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/L），按1.2.2項方法制備供試溶液。按低、中、高3個濃度水平加標(biāo)，每個加標(biāo)濃度水平制備3份，按本法測定含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 3種類型酒回收率測定結(jié)果（n=9）

2.2.7 樣品測定 取白酒、啤酒、葡萄酒各2批，每批樣品制備5份待測溶液，按本法測定氰化物含量，結(jié)果見表2。

表2 3種類型酒樣品測定結(jié)果（n=5）

3 討論

該方法測定原理為在堿性條件下加熱除去酒中高沸點有機物，然后在pH 5.0條件下，用氯胺T將氰化物轉(zhuǎn)變?yōu)槁然?，再與異煙酸發(fā)生戊二烯醛反應(yīng)，其產(chǎn)物能與巴比妥酸生成藍(lán)色染料，再經(jīng)高效液相色譜分離后以峰面積外標(biāo)法計算含量。與現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)異煙酸-吡唑啉酮分光光度法[6]對比，如表3所示，采用異煙酸-巴比妥酸作為衍生試劑可在更寬的pH值范圍內(nèi)較快達(dá)到反應(yīng)穩(wěn)定，簡化了操作；通過HPLC分離后測定，可提高方法的靈敏度、準(zhǔn)確度，也有更好的樣品適應(yīng)性。

表3 2種方法比較結(jié)果

4 結(jié)論

本文采用異煙酸-巴比妥酸為柱前衍生試劑，建立了HPLC測定酒中氰化物方法。結(jié)果表明，此法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、穩(wěn)定性好，有較好的樣品適用性，可為酒中氰化物測定的標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。