Lesinurad原料藥中7種有機(jī)溶劑殘留的測定

張相軍，鄧玉曉，翟 宇，張憲科，趙仁永

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東魯環(huán)檢測科技有限公司，山東 濟(jì)南 250101）

Lesinurad{2-[（5-溴-4-（4-環(huán)丙基萘-1-基）-4H-1, 2, 4-三唑-3-基）硫代]乙酸}是一種選擇性尿酸重吸收抑制劑[1]，能選擇性地作用于尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（URAT1）[2]和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（OAT4）[3]，從而降低血尿酸濃度。Lesinurad由阿斯利康（AstraZeneca）公司[4]的子公司Ardea生物科技公司[5]研制，2015年12月22日獲得FDA批準(zhǔn)，商品名：Zurampic[6]，為全球首個URAT1抑制劑，臨床聯(lián)合黃嘌呤氧化酶抑制劑（如別嘌醇，非布司他）治療高尿酸血癥相關(guān)痛風(fēng)[7]。目前《中國藥典》2015年版二部、EP9.0、JP17與USP40均未收載該藥，尚未見關(guān)于Lesinurad原料藥中有機(jī)溶劑殘留量檢測的報道。根據(jù)Lesinurad的合成工藝[8-9]，生產(chǎn)的后5步中分別使用了二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、四氫呋喃和正己烷等有機(jī)溶劑。為確保藥品的安全、有效和質(zhì)量可控，根據(jù)《中國藥典》2015年版四部的相關(guān)規(guī)定及人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（ICH）指導(dǎo)原則的相關(guān)規(guī)定，應(yīng)增加有機(jī)溶劑的檢查。因此，本文對Lesinurad原料藥的殘留溶劑進(jìn)行了考察，建立了氣相色譜法（GC）測定Lesinurad原料藥中7種殘留溶劑的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

GC-2010 Plus氣相色譜儀（日本島津）；AOC-20i型自動進(jìn)樣塔（日本島津）；GC-14A/B型氫火焰離子化檢測器（日本島津）；XS205型天平（梅特勒-托利多）。

1.2 藥品與試劑

Lesinurad原料藥（山東省藥學(xué)科學(xué)院，批號：121201，121202，121203；純度：99.8 %，99.8 %，99.7 %），二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲苯為分析純，DMF、四氫呋喃、正己烷、N,N-二甲基乙酰胺為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

固定相為Rtx-502.2毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，1.80 μm）；程序升溫，初始柱溫40 ℃，保持2 min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至200 ℃。進(jìn)樣口溫度180 ℃，分流比為20:1；氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為220 ℃。載氣：高純氮?dú)?，流?.0 ml/min。直接進(jìn)樣1 μl。

2.2 溶液配制

2.2.1 空白溶液的制備 以N,N-二甲基乙酰胺作為空白溶液。

2.2.2 對照品貯備液的制備 稱取二氯甲烷300 mg、乙酸乙酯2500 mg、丙酮2500 mg、甲苯150 mg、DMF 440 mg、四氫呋喃360 mg、正己烷145 mg，置入有適量N,N-二甲基乙酰胺的100 ml量瓶，充分振搖使溶解，加N,N-二甲基乙酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密量取上述對照品儲備液2 ml，置入100 ml量瓶，加N,N-二甲基乙酰胺至刻度，搖勻，作為對照品溶液（限度濃度）。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密稱取Lesinurad 1.0 g，置入10 ml量瓶，加N,N-二甲基乙酰胺溶解并定容，作為供試品溶液。

2.3 專屬性試驗

取2.2項下空白溶液、對照品貯備液和對照品溶液，按2.1項下色譜條件檢測。結(jié)果顯示，丙酮、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯、DMF的保留時間分別為2.658，3.304，3.721，4.995，5.526，10.326，12.356 min，相鄰色譜峰分離度均大于1.5，溶劑峰不干擾各組分的測定，方法專屬性良好，色譜圖見圖1。

圖1 GC圖譜

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取對照品貯備液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.2 ml，置入50 ml量瓶，加N,N-二甲基乙酰胺稀釋至刻度，搖勻。按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣。分別以二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲苯、DMF、四氫呋喃與正己烷的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性關(guān)系見表1。

表1 二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲苯、DMF、四氫呋喃與正己烷的線性關(guān)系考察結(jié)果

由表1可知，二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲苯、DMF、四氫呋喃與正己烷在線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取對照品溶液，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計算峰面積RSD（n=6），二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲苯、DMF、四氫呋喃與正己烷峰面積RSD（n=6）分別為0.95 %，0.81 %，1.14 %，0.89 %，2.08 %，0.78 %，0.64 %，表明精密度符合要求。

2.6 準(zhǔn)確度試驗

精密稱取樣品（批號：121201）1.0 g，置入10 ml量瓶，共12份，其中3份分別用N,N-二甲基乙酰胺溶解并定容，作為空白溶液。分別配制低濃度（限度濃度的80 %）、中濃度（限度濃度的100 %）、高濃度（限度濃度的120 %）3種濃度的對照品溶液，取供試品，分別采用上述3種不同濃度的對照品溶液溶解并定容，每個濃度配制3份。以2.2項下的對照品溶液作為對照。按2.1項下色譜條件，分別進(jìn)樣測定?；厥章试囼灲Y(jié)果見表2。

表2 二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲苯、DMF、四氫呋喃與正己烷的回收率試驗結(jié)果

由表2可知，二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲苯、DMF、四氫呋喃與正己烷的回收率符合要求。

2.7 定量限與檢出限

將對照品溶液逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，直至信噪比為10:1和3:1，即為定量限和檢出限。丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯、DMF、四氫呋喃與正己烷定量限分別為0.06，0.145，0.06，0.036，0.2，0.173，0.070 ng；二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲苯、DMF、四氫呋喃與正己烷檢出限分別為0.02，0.048，0.02，0.012，0.070，0.058，0.023 ng。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批（批號：121201）樣品6份，每份約1.0 g，精密稱定，分別置入10 ml量瓶，按2.2項方法制備供試品溶液并測定。乙酸乙酯平均含量為0.022 %，RSD=0.87 %。表明方法重復(fù)性良好。

2.9 耐用性試驗

通過改變初始柱溫、進(jìn)樣口溫度、檢測器溫度和載氣流速等參數(shù)，對照品溶液中各組分分離度均大于1.5。表明該方法的耐用性良好。

2.10 樣品測定

取本品3批（批號：121201，121202，121203），按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計算得3批樣品的乙酸乙酯殘留量平均值分別為0.029 %，0.021 %和0.019 %，3批樣品中均未檢出二氯甲烷、丙酮、甲苯、DMF、四氫呋喃與正己烷。

3 討論

3.1 色譜柱的篩選

前期實驗分別選用了安捷倫HP-5色譜柱、Rtx-502.2色譜柱、聚乙二醇2K色譜柱，發(fā)現(xiàn)非極性色譜柱HP-5不能有效分離各組分，極性色譜柱聚乙二醇2K有雜峰干擾；采用中等極性的Rtx-502.2色譜柱能很好地分離各組分，且溶劑與供試品均未出現(xiàn)干擾峰，因此選用中等極性的Rtx-502.2色譜柱。

3.2 進(jìn)樣方式的考察

對于進(jìn)樣方式，前期試驗考察了頂空進(jìn)樣和直接進(jìn)樣，結(jié)果采用頂空進(jìn)樣時，由于各組分的限度差別過大，甲苯和二氯甲烷限度濃度幾乎檢測不到，靈敏度明顯低于直接進(jìn)樣。因此選用直接進(jìn)樣方式。

3.3 溶劑的選擇

Lesinurad原料合成路線中用到了DMF，需檢測DMF的殘留，因此，選擇N,N-二甲基乙酰胺為溶劑。