基于近紅外分析技術快速測定燈盞花素注射液的含量

（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

燈盞花系菊科正蓬屬植物，具有解表散寒、活血化瘀、疏經活絡、止痛消積等作用。燈盞花素提取自燈盞花，主要成分為燈盞乙素，燈盞花素注射液為燈盞花素的滅菌水溶液，功能主治為活血化瘀，通絡止痛，用于中風后遺癥、冠心病、心絞痛，在心腦血管疾病中應用廣泛[1-2]。燈盞花素注射液現(xiàn)執(zhí)行《中藥成方制劑》第20冊標準，采用紫外吸收系數(shù)法測定其含量[3]，耗費的儀器、人力、時間成本較大，且無法進行現(xiàn)場檢測。為解決這些問題，本文提出一種快速測定燈盞花素注射液含量的方法，以解決偏遠地區(qū)藥品檢測問題，應對自然災害、突發(fā)性公共衛(wèi)生事件現(xiàn)場的藥品快速檢測。

近紅外光譜分析技術在分類鑒別、含量確定、在線檢測等方面具有無可比擬的優(yōu)勢[4-6]。本文通過將近紅外透反射光譜分析技術和偏最小二乘算法（PLS）相結合，構建了燈盞花素注射液快速定量分析模型，并對模型進行了優(yōu)化和驗證，以開拓中藥注射液在快速定量分析方面的應用。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

Matrix-F型近紅外光譜儀（德國布魯克公司），配備有1.5 m固體光纖探頭和1號（光程1 mm）液體測樣附件；銦鎵砷（In，Ga，As）檢測器；5.0版本OPUS分析軟件（德國布魯克公司）及定量2軟件包；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯公司）；UV-2600紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.2 樣品

2個廠家27批燈盞花素注射液，均為本單位抽驗樣品；同時，通過稀釋的方法在實驗室自制了54個不同濃度梯度的樣品。

2 方法

2.1 含量測定

根據《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第二十冊》標準，采用紫外吸收法測定燈盞花素注射液中燈盞花素（以燈盞花素乙素計）含量[3]。

2.2 測定近紅外光譜

近紅外光譜采集的波數(shù)范圍為12 000～4 000 cm-1，分辨率為8 cm-1，室溫。實驗采樣方式為透反射。借助固體光纖探頭及1號（光程1 mm）液體采樣附件, 通過將樣品滴加到采樣附件的方式測定樣品的近紅外光譜。每批樣品選用6瓶測定原始光譜，并求平均光譜作為建模光譜。

2.3 建立定量模型

建模選用的OPUS5.0分析軟件及附帶定量2軟件包的基本原理是PLS，用交叉驗證均方根誤差（RMSECV）評價建模準確性，其具體數(shù)學表達如下。

其中，Nc、CVi和Yi分別表示校正集樣品數(shù)量、交叉驗證中樣品i的預測值和真實測定值。

2.4 模型驗證

2.4.1 準確性 選取未參與建模的20批來自2個生產企業(yè)的燈盞花素注射液，驗證模型準確性。通過比較近紅外光譜預測值與真值的偏差及將預測值與真值在95 %的置信區(qū)間內進行配對t-檢驗，評價模型準確性。

2.4.2 專屬性 偏最小二乘校正模型的溢出值用馬氏距離[7]衡量，并進行專屬性評價，其計算方法如下。

其中，MD、Xi和Xj、、S分別表示馬氏距離、原始數(shù)據、元素平均值和基于建模所選PLS矢量數(shù)的協(xié)方差。

燈盞花素注射液的定量模型限定值（Threshold）按下式計算，結果為0.17。

其中，Rank表示PLS矢量數(shù)，為7；M表示建模樣本數(shù)，為81；Factor為2。

實驗選擇10批燈盞花素注射液（S）及3批相同劑型的丹參酮注射液（T）進行模型專屬性測試，將測得的馬氏距離與模型限定值進行比較，評價模型的專屬性。

2.4.3 線性 將81批建模樣品的真值與近紅外預測值做線性回歸，評價方法的相關性。

2.4.4 精密度 通過重復性和中間精密度評價所建方法的精密度。同一操作者對同一樣品在同一天內重復測定6次，通過置信區(qū)間和標準偏差評價重復性；兩個操作者對同一樣品在3 d內各重復測定3次，通過置信區(qū)間及方差分析評價中間精密度。

3 結果與討論

3.1 校正集、驗證集樣品的選擇

內部交叉驗證法適用于建模樣品數(shù)量小于100批時的建模[8-9]。本研究中樣本81批次，故將所有樣品作為校正集用于模型建立。81批次樣品的含量分布見圖1。

圖1 81批次樣品的含量分布

3.2 近紅外光譜校正模型

為了突出活性成分的信息，建立穩(wěn)健、準確的近紅外光譜校正模型，我們選取了特定的譜段、適合的光譜預處理方法。

3.2.1 建模譜段的選擇 近紅外光譜中波數(shù)大于10 000 cm-1部分屬于末端吸收，其強度很弱且會形成噪音干擾，而波數(shù)小于4200 cm-1部分由于邊緣效應和噪音的存在易形成干擾，通常建模時不選擇這兩個區(qū)域[10-11]。水的合頻吸收波數(shù)約在5155 cm-1處，其呈現(xiàn)出寬頻帶高峰值特點，建模時同樣不予考慮[12-13]。

以RMSECV、R2及Rank值為評價標準，進行近紅外光譜模型的譜段敏感性分析，并參考OPUS軟件的自動優(yōu)化結果，優(yōu)化確定的建模譜段為7502～5446 cm-1和4602～4247 cm-1，該譜段所建立的模型RMSECV最小，R2最大，Rank值在6～10之間。由表1可見，模型1對應的譜段為最優(yōu)譜段。本研究中保留的建模譜段為7502～5446 cm-1和4602～4247 cm-1，見圖2。

圖2 建模所選擇的譜段范圍

表1 不同譜段建立模型結果對比

3.2.2 光譜預處理 一階導+矢量歸一化的預處理方法一方面可提高活性成分相關的光譜吸收信息，降低光譜平移的影響；另一方面，可提高分辨率和靈敏度，同時改善背景信息干擾，分辨重疊峰。而平滑處理可有效地消除光譜噪聲[14-15]。本研究中采用一階導+矢量歸一化+17點平滑的預處理方法，樣品的原始光譜見圖3，經預處理后的光譜見圖4。由圖3、圖4可見，預處理降低了原始光譜的背景和噪聲干擾，增強了光譜特征，提高了信噪比。

圖3 建模樣品的原始光譜

圖4 預處理后的近紅外漫反射光譜

3.2.3 確定最優(yōu)模型 通過內部交叉驗證、模型穩(wěn)健性理論及OPUS軟件自動優(yōu)化結果的比較，多次優(yōu)化所確定的最優(yōu)模型參數(shù)見表2。內部交叉驗證相關性結果見圖5、圖6。

表2 多次優(yōu)化確定最優(yōu)模型參數(shù)

圖5 燈盞花素注射液近紅外定量模型內部交叉驗證結果

圖6 燈盞花素注射液近紅外定量模型RMSECV和Rank相關性圖

3.3 模型驗證結果

3.3.1 準確性 結果見表3。近紅外光譜預測值與真實值相比較，最小絕對偏差為0.01 mg/ml，最大絕對偏差為0.21 mg/ml，平均偏差為0.08 mg/ml；最小相對偏差為0.5 %，最大相對偏差4.7 %，平均相對偏差為2.3 %。通常，近紅外快檢方法的偏差上限要求為5 %，因此，本次所建立的模型對驗證集的預測誤差均滿足快檢要求。進一步，將驗證集的預測值與真實值在95 %的置信區(qū)間內進行配對t-檢驗的結果顯示，在95 %的置信區(qū)間內，P值為1.691，大于0.05，這說明表明本次建模的預測結果與法定方法沒有明顯差別。

表3 模型對樣品集的預測結果

3.3.2 專屬性 結果見表4。所有樣品的馬氏距離均小于0.17，全部通過測試。所有樣品的馬氏距離均大于模型限定值，全部未通過測試，詳見表4，說明本次所建立的燈盞花素注射液定量模型專屬性良好。

表4 模型專屬性

3.3.3 線性 本研究所建立方法的線性方程為：Y=0.9486X+0.31，r=0.994，r越接近1表明預測值越接近于真實值。近紅外二級方法，通常r大于0.95即可滿足近紅外快檢要求，故本方法的線性良好。

3.3.4 精密度 本文以重復性和中間精密度兩方面評價精密度。重復性試驗中，真實值為2.1126 mg/ml，6次測定的平均值為2.1071 mg/ml，標準偏差為0.17 mg/ml，置信區(qū)間1.9272～2.2781 mg/ml。中間精密度試驗中，真實值為2.1021 mg/ml，6次結果的平均值為2.1953 mg/ml，標準偏差為1.2 mg/ml，對測定結果進行方差分析，得P＞0.05。以上結果表明所建方法的精密度良好。

4 結論

本研究基于近紅外光譜分析技術結合PLS建立了快速測定燈盞花素注射液含量的方法。所建模型可對全國范圍內不同生產企業(yè)的燈盞花素注射液進行定性和定量。中藥注射液含量較低，且建模樣本含量范圍較窄，通過實驗室自制補充了梯度濃度的樣品，最終所建模型的預測準確性及耐用性均良好，適用于藥品快速篩查及一線藥品質量控制，具有推廣應用價值。同時為近紅外光譜分析技術在中藥注射液定量分析方面的應用提供了參考。