外泌體的提取、貯存及其臨床應(yīng)用進(jìn)展

張芮浩，張曉勃綜述，袁文歡，周海宇審校

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅 蘭州 730030；

2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730030；

3.內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭一附院核磁科，內(nèi)蒙古包頭 014010；

4.蘭州市西固區(qū)人民醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730060

外泌體是細(xì)胞分泌的納米級細(xì)胞外囊泡，大小30～150 nm，攜帶核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他生物活性物質(zhì)，在人體的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。外泌體首先發(fā)生于內(nèi)體膜的內(nèi)陷，內(nèi)陷后形成細(xì)胞內(nèi)囊泡，隨著小囊泡的積累，內(nèi)體轉(zhuǎn)化為多囊體。多囊體大部分進(jìn)入溶酶體后被降解，其余的在與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外，成為細(xì)胞外囊泡。外泌體最初由JOHNSTONE等［1］在體外培養(yǎng)綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時被認(rèn)為是“細(xì)胞灰塵”，為細(xì)胞處置自身廢物的一種機(jī)制，因此并未引起注意。2007年，VALADI等［2］首次證實(shí)外泌體同時含有功能性mRNA和miRNA，它們可以轉(zhuǎn)移至其他細(xì)胞，并在稱為“外泌體穿梭RNA”的新位置發(fā)揮作用。自此，外泌體引起了廣泛關(guān)注。與脂質(zhì)體和其他納米顆粒等載體相比，外泌體由于其內(nèi)在特性，在疾病診斷和治療領(lǐng)域具有廣泛而獨(dú)特的優(yōu)勢。但外泌體的提取純化以及貯存等條件限制了其臨床應(yīng)用。因此，需進(jìn)一步探索優(yōu)化外泌體的提取和貯存條件，促進(jìn)后續(xù)外泌體功能的研究。本文對外泌體的特性、提取和貯存手段及其臨床應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 外泌體的特性

外泌體的特征是小RNA的聚集，包括mRNA、miRNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）和長鏈非編碼RNA（lnc-RNA）［3-4］。這些RNA分子與蛋白質(zhì)一起作為遺傳物質(zhì)，通過外泌體轉(zhuǎn)移并在細(xì)胞間傳遞通訊信息［5］。外泌體通過與細(xì)胞膜或配體結(jié)合，將信號傳遞給受體細(xì)胞后，導(dǎo)致受體細(xì)胞的行為發(fā)生變化［6-7］。在外泌體生成和釋放的不同階段，外泌體貨物和膜的組成會發(fā)生變化，從而導(dǎo)致異質(zhì)性外泌體種群。外泌體所攜帶的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)類似于起源細(xì)胞中的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，它們與受體細(xì)胞相互作用以觸發(fā)貨物釋放或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)誘導(dǎo)，最終導(dǎo)致細(xì)胞活性或功能的改變［8］。與干細(xì)胞和其他成分相比，外泌體具有性質(zhì)穩(wěn)定、易保存、易轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)，且具有非免疫原性。其為無細(xì)胞靶向治療的合適選擇，可作為特定基因或治療疾病的藥物的載體［9］。

2 外泌體的提取純化

當(dāng)前用于分離外泌體的主要純化方法包括超速離心法（ultracentrifugation，UC）、尺寸排阻色譜法、聚合物沉淀法（試劑盒法）。UC是通過離心作用分步去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大囊泡，再沉淀外泌體。由于其操作簡單，外泌體回收率高，是最常用的外泌體純化方法。但UC會破壞外泌體的完整性，且蛋白質(zhì)污染率高［10］。盡管有研究表明UC可有效地從黏度較低的液體（如培養(yǎng)基、尿液和灌洗液）中提取外泌體，但從黏性液體（如血清）中回收外泌體的效率較低［11］。研究顯示，在外泌體顆粒和蛋白質(zhì)回收率方面，尺寸排阻色譜法優(yōu)于UC［12］。外泌體聚合物沉淀法是將含有聚合物的沉淀溶液與生物體液混合，從而沉淀外泌體。目前已有成熟的PEG-base商業(yè)試劑盒（如ExoQuickTM）。試劑盒提取方法可以獲得純度較高的外泌體，且操作簡單，不需要高度精密的儀器設(shè)備。用外泌體RNA分離試劑盒獲得的RNA含量高于UC［11，13］。

但上述外泌體的分離和提取方法較費(fèi)時，而且很大程度上取決于預(yù)分離步驟。這些方法會導(dǎo)致外泌體和外泌體RNA的濃度、純度以及大小發(fā)生變化［13-14］。使用商業(yè)提取試劑盒需大量的樣品進(jìn)行處理，試劑盒和試劑昂貴，操作繁瑣且設(shè)備復(fù)雜，結(jié)果易出現(xiàn)偏差［15］。增加產(chǎn)量和純度并保持其生物學(xué)特性的標(biāo)準(zhǔn)化分離方法是目前限制外泌體應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)，開發(fā)更有效的外泌體分離方法將促進(jìn)外泌體藥物遞送（如基于核酸的藥物）系統(tǒng)的開發(fā)。外泌體鑒定方法包括形態(tài)鑒定（電子顯微鏡）、粒度測量（直徑分析）和標(biāo)記蛋白檢測（蛋白質(zhì)印跡），其中，透射電子顯微鏡用于清晰觀察外泌體的大小和形狀，被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)鑒定方法［16］。

3 外泌體的貯存

貯存溫度是維持細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）活性的重要因素［17］。先前的研究表明，高溫貯存減少了外泌體保留的數(shù)量和外泌體含量，而在-80℃下貯存則引起較少的變化［18-19］。因此，目前在磷酸鹽緩沖液中通常的貯存條件是-80℃。最近的研究表明，低溫會影響EV脂質(zhì)膜的穩(wěn)定性，而在低溫下形成的冰晶會造成機(jī)械損傷，甚至損壞脂質(zhì)膜，并導(dǎo)致其含量及相應(yīng)的生物學(xué)功能喪失［20］。在20或4℃下保存1 d，EV的抗菌作用會大大降低。在-20℃下貯存28 d，會導(dǎo)致EV尺寸變化和抗菌功能喪失［21］。盡管在-80℃下貯存會對外泌體的數(shù)量和大小產(chǎn)生較大影響，但其可部分保留28 d的抗菌功能，極大改變了EV的結(jié)構(gòu)和功能特性。當(dāng)需要進(jìn)行功能測試時，最好使用剛提取的EV［21］。由于外泌體的存貯時間較短，商業(yè)化外泌體無法確保其功能的完整性，需進(jìn)一步完善外泌體的保存條件。

與先前研究不同，MAROTO等［22］發(fā)現(xiàn)，在冰凍條件下，外泌體的大小增加，在4℃下貯存的外泌體直徑增加了10%，在-80℃下貯存的外泌體直徑增加了25%，而且促進(jìn)了多層囊泡的形成和聚集，影響外泌體的蛋白質(zhì)含量。盡管研究報道在-80℃下貯存的外泌體大小存在差異，但均表明低溫貯存條件會導(dǎo)致外泌體生物學(xué)功能逐漸喪失。

冷凍干燥或噴霧干燥是新開發(fā)的一種外泌體存儲方法，可代替冷藏貯存，而且對外泌體的結(jié)構(gòu)和功能維持更有益，但目前尚未摸索出最佳的保存環(huán)境［23-24］。此外，細(xì)胞外囊泡的不同來源和樣品制備過程也會影響細(xì)胞外囊泡的質(zhì)量和穩(wěn)定性，如凍融循環(huán)次數(shù)的增加將導(dǎo)致EV粒子數(shù)量的減少和內(nèi)容物的快速降解，有必要適當(dāng)減少外泌體使用過程中的凍融循環(huán)次數(shù)［25-26］。

4 外泌體在腫瘤中的研究進(jìn)展

惡性腫瘤一直是人類社會面臨的巨大難題，雖然醫(yī)學(xué)治療方式已發(fā)生很大變化，但外科手術(shù)和全身化療仍是主要的治療方式，患者死亡率高，預(yù)后較差。外泌體作為一種非常有效的基因載體，避免了病毒載體的風(fēng)險，其攜帶靶向基因藥物微創(chuàng)治療疾病，具有較大的臨床應(yīng)用前景。

其次，外泌體本身也在腫瘤的疾病發(fā)展中起重要作用。其通過促進(jìn)血管生成［27］、侵襲轉(zhuǎn)移［28］、免疫逃逸［29］以及耐藥抗性［30］等方面參與腫瘤的癌癥特性，miRNA作為外泌體攜帶的內(nèi)容物在其中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。這些miRNA可作為旁分泌藥物調(diào)節(jié)腫瘤的微環(huán)境，包括免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等［31］。那些在腫瘤和正常組織中表達(dá)差異的miRNA可作為腫瘤的標(biāo)志物。此外，抑制或上調(diào)腫瘤中的RNA分子也可能是一種有效的治療策略。

5 外泌體的應(yīng)用

外泌體作為生物載體具有生物活性，可在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)運(yùn)其內(nèi)含物，從而導(dǎo)致受體細(xì)胞功能的改變［32］。其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有許多潛在用途，研究廣泛集中于惡性腫瘤治療、藥物傳遞和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［33］。外泌體通過細(xì)胞間的通訊介導(dǎo)癌癥的轉(zhuǎn)移、耐藥性以及免疫反應(yīng)［34］。其不僅在腫瘤發(fā)生、血管生成和轉(zhuǎn)移中起重要作用，還抑制腫瘤的進(jìn)展［35］。由于外泌體幾乎存在于機(jī)體分泌的所有體液中，而且可在體液中檢測到，因此被認(rèn)為是疾病診斷的無創(chuàng)或微創(chuàng)生物標(biāo)志物，具有檢測包括癌癥在內(nèi)的許多疾病病理狀態(tài)的潛力［36］。它們存在于各種體液中，如血清、唾液或尿液，可輕松地從患者身上采集血液樣本進(jìn)行分離，然后用于鑒定外泌體中的特定RNA分子或蛋白質(zhì)，是一種完美的無創(chuàng)診斷/預(yù)后技術(shù)［37-38］。外泌體由于其表面包含多種黏附蛋白，納米顆粒大小和可變形性使其能夠跨越主要的生物屏障，成為基因治療的藥物載體［39-40］。

研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可同時發(fā)揮免疫激活和免疫抑制功能，腫瘤免疫療法為腫瘤研究領(lǐng)域的新型療法。來自免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的外泌體部分充當(dāng)腫瘤免疫學(xué)的調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展［41］。POGGIO等［42］發(fā)現(xiàn)，去除外泌體PD-L1后，會抑制腫瘤的生長。來自腫瘤的外泌體PD-L1抑制引流淋巴結(jié)中的T細(xì)胞活化，外泌體PD-L1代表1個治療靶標(biāo)，可克服目前對抗體療法的耐藥性。轉(zhuǎn)移是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素，為癌癥死亡的主要原因，也是外泌體介導(dǎo)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的通訊機(jī)制［43］。降低腫瘤外泌體至正常水平，可能是防止癌癥惡化的有效療法。目前的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可作為腫瘤疾病的治療靶點(diǎn)［44］。目前，miRNA被認(rèn)為是潛在的抗癌藥物，但傳遞miRNA、蛋白質(zhì)和化學(xué)藥物的常規(guī)方法通常無法產(chǎn)生理想的效果。外源性miRNA在體內(nèi)易降解，由于缺乏天然構(gòu)象，外源性蛋白質(zhì)無法執(zhí)行所需的功能，所用化學(xué)藥物對正常細(xì)胞具有致命性。使用外泌體作為載體可解決上述問題，外泌體傳遞的分子靶向藥物作用于腫瘤細(xì)胞，可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［45］。此外，其還可用于腫瘤的預(yù)后監(jiān)控［46］?？衫猛饷隗w作為生物標(biāo)志物、疫苗和藥物載體，并對其進(jìn)行合理的修飾，以進(jìn)行治療性干預(yù)。

6 小結(jié)

外泌體的提取方法雖然具有多樣化，但仍無法確定哪種方法絕對有效，目前，研究者可能更傾向于試劑盒提取法。此外，外泌體的貯存具有時效性，且受多種因素影響，需在提取后盡快使用，因此，開發(fā)新型貯存方法來保持外泌體的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，具有極大的研究價值和臨床應(yīng)用前景。在臨床應(yīng)用方面，準(zhǔn)確有效地鑒定、分離和量化外泌體仍面臨巨大的挑戰(zhàn)，將進(jìn)一步探索外泌體在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的潛力，并為創(chuàng)建有效的臨床診斷和治療策略提供新的途徑。