狂犬病病毒aG株在人用狂犬病疫苗中應(yīng)用的研究進展

石磊泰 綜述，李玉華 審校

中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主的一種動物源性傳染病，病死率幾乎100%。全球每年狂犬病死亡例數(shù)約60 000例，主要發(fā)生在亞洲和非洲，我國為狂犬病流行國家［1-2］，狂犬病疫苗是預(yù)防狂犬病的主要手段。1931年，研究者從狂犬病病犬腦中分離獲得狂犬病病毒，隨后通過兔腦傳代，馴化為一種固定毒：1~10代的潛伏期不穩(wěn)定，波動在10～26 d；30代后的潛伏期穩(wěn)定在6 d。將該毒株命名為“北京株”，適應(yīng)31代后用于制備狂犬病疫苗，該株病毒毒力略強于法國、德國、意大利、波蘭、印度等國家的毒株，具有免疫原性好、遺傳穩(wěn)定的特點，用其生產(chǎn)的狂犬病疫苗有效性良好［3］。20世紀60~70年代，研究者將狂犬病病毒北京株通過豚鼠腦傳代與原代地鼠腎細胞交替?zhèn)鞔姆椒ㄟm應(yīng)于原代地腎細胞培養(yǎng)，用于狂犬病疫苗生產(chǎn)。該毒株免疫原性好、毒性穩(wěn)定，可用于生產(chǎn)兔腦或羊腦狂犬病疫苗。由于腦組織疫苗接種后不良反應(yīng)嚴重，且需連續(xù)注射14針，逐漸被淘汰。1965年，經(jīng)多家機構(gòu)合作，將狂犬病病毒北京株在豚鼠腦和原代地鼠腎細胞中交替?zhèn)鞔?5年，獲得地鼠腎細胞適應(yīng)株，命名為“aG株”，目前仍用于人用狂犬病疫苗生產(chǎn)［4-8］。本研究就狂犬病病毒aG株的傳代適應(yīng)方法、基因特性及其制備相應(yīng)疫苗的免疫保護作用作一綜述。

1 傳代適應(yīng)

1.1在原代地鼠腎細胞傳代適應(yīng) 1965年，經(jīng)多家機構(gòu)合作，用狂犬病病毒北京株在原代地鼠腎細胞傳代適應(yīng)，成功研制了原代地鼠腎細胞培養(yǎng)滅活疫苗，毒種的適應(yīng)傳代包括3個過程：①用狂犬病病毒北京株的兔腦固定病毒感染2～3周齡的地鼠腎單層細胞，于36～37℃培養(yǎng)約2周（期間更換培養(yǎng)基1～2次），棄上清液，用胰蛋白酶消化制成細胞懸液，加入適量新鮮制備的正常原代地鼠腎細胞懸液，混合培養(yǎng)2周；按上述方法進行消化，加入正常原代地鼠腎細胞繼續(xù)培養(yǎng)（稱為混合培養(yǎng)法），連續(xù)培養(yǎng)4代，病毒滴度達2～3 lgLD50/mL［4-5］。②將第4代病毒液直接接種于正常原代地鼠腎單層細胞中，培養(yǎng)約5 d；根據(jù)病毒繁殖高峰，取病毒培養(yǎng)上清，接種地鼠腎單層細胞繼續(xù)傳代。病毒滴度在10代以內(nèi)均較低，繁殖高峰期約為20 d；在37～43代期間，滴度上升至4～4.5 lgLD50/mL，繁殖高峰縮短至8～10 d；44代后病毒滴度約穩(wěn)定在4.5 lgLD50/mL，繁殖高峰期穩(wěn)定在5～7 d；繼續(xù)傳至第68代，病毒滴度未增加，繁殖高峰未進一步下降［4-5］。在傳代過程中，均未發(fā)現(xiàn)細胞病變，將這株地鼠腎細胞適應(yīng)株稱為“a”株。③為進一步提高a株的病毒滴度，將第55代a株病毒在豚鼠腦內(nèi)和地鼠腎細胞交替進行傳代，傳至第3代時，該病毒的滴度提高至4.5～5.5 lgLD50/mL或更高，即aG株，用于生產(chǎn)原代地鼠腎細胞組織培養(yǎng)的疫苗［4-5］。

將aG株的生物學特性和穩(wěn)定性與北京株固定病毒進行比較，結(jié)果表明，aG株對小鼠、豚鼠、家兔、狗和猴基本喪失了對周圍神經(jīng)的致病性，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致病性也顯著降低；交叉保護和交叉中和試驗表明，兩者的抗原性相似，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）［4-7］。

1.2在V e ro細胞傳代適應(yīng) 20世紀90年代，有研究將aG株在Vero細胞上進行適應(yīng)傳代，傳代后病毒滴度可提高至疫苗生產(chǎn)要求的水平［9-12］。蔣茨蕾等［13］也曾嘗試用Vero細胞傳代aG株，獲得的培養(yǎng)物具有較低毒力及較高免疫原性。鄭海發(fā)等［14］為使aG株適應(yīng)Vero細胞，用提取的含3aG-5株病毒的豚鼠腦懸液按0.1 LD50/個的劑量感染Vero細胞，加入含0.7%牛血清Eagle′s的MEM（pH 7.6），于37℃靜置培養(yǎng)48 h；更換加入含3%牛血清的MEM，34℃培養(yǎng)4 d，收集液體，即為3aG-V1株，采用相同方法繼續(xù)傳代，獲得3aG-V35。有研究采用小鼠、豚鼠、家兔和犬為研究對象，通過不同途徑感染狂犬病病毒3aG-V株，探討該毒株的致病性及免疫原性，結(jié)果表明，狂犬病病毒3aG-V株潛伏期較長，在動物腦內(nèi)不形成尼氏小體，表明該毒株是一種固定毒，對實驗動物的致病性較弱，具有良好的免疫原性，可作為疫苗株生產(chǎn)Vero細胞狂犬病疫苗［14］。另有研究對3aG-V株進行了毒株形態(tài)、培養(yǎng)條件、致病性、免疫原性、毒力試驗研究，并檢測了病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成包涵體的情況，結(jié)果表明，狂犬病病毒3aG-V株抗原性好、培養(yǎng)產(chǎn)毒量高、毒力低、傳代穩(wěn)定、無突變，且滅活后有效性及安全性良好［15］?？袢〔《?aG-V株在Vero細胞上傳代多次，滴度可達8.3 lgLD50/mL，具有良好的抗原性和免疫原性，并確定了狂犬病病毒3aG-V株在Vero細胞上的種毒量在0.1~0.01 LD50/個之間病毒滴度最高，表明3aG-V株可在Vero細胞上長期增殖，并認為其可替代原代地鼠腎細胞狂犬病疫苗aG株進行Vero細胞培養(yǎng)，用于生產(chǎn)人用狂犬病疫苗［16-19］。

1.3在雞胚成纖維細胞傳代適應(yīng) 王遠征等［20］為探討狂犬病病毒aG株對原代雞胚成纖維細胞的傳代適應(yīng)性，將北京株10aG豚鼠腦毒種在雞胚成纖維細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，取第11、21、31代病毒收獲液，用小鼠腦毒力測定法測定病毒滴度，并采用正交試驗篩選最佳病毒培養(yǎng)條件，按最佳比例接種病毒，繪制病毒生長曲線，同時進行特異性和免疫原性檢測，結(jié)果表明，狂犬病病毒aG株對雞胚成纖維細胞無明顯的細胞病變作用，病毒含量隨傳代次數(shù)的增加呈上升趨勢，第11、21和31代病毒收獲液的效價分別為4.0、7.7、7.17 lgLD50/mL；經(jīng)多次傳代，最適培養(yǎng)條件為：細胞濃度1.5×106個/mL，接種比例1∶500，血清濃度2%，收獲時間5 d。連續(xù)收獲3次病毒后，細胞開始脫落，病毒滴度可達7.0 lgLD50/mL以上，中和指數(shù)可達8 500；第21代病毒制備的疫苗效價為2 IU/mL。上述結(jié)果表明，北京株10aG株豚鼠腦病毒株可適應(yīng)雞胚細胞的培養(yǎng)，為雞胚成纖維細胞狂犬病疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

1.4在二倍體細胞適應(yīng) 王輝等［21］在2013年申請了一項科技專利，即采用狂犬病病毒aG株在人二倍體細胞上傳代與挑斑結(jié)合的方法傳代培養(yǎng)狂犬病病毒aG株，當病毒滴度達4.7 lgLD50/mL后，將10倍系列稀釋的病毒液與消化分散的2BS細胞共同接種至6孔板，進行挑斑，挑選出抗原含量高的病毒克隆后，繼續(xù)在小方瓶中傳代適應(yīng)，獲得狂犬病病毒aG株人二倍體細胞適應(yīng)株，即CGMCC No.7307，但目前尚未見該項專利后續(xù)研究工作的相關(guān)報道。

2 基因特性

2.1糖蛋白（G）和核蛋白（N）的基因特性 狂犬病病毒G蛋白是決定抗原性及組織嗜性與毒力的最重要部分［22］。白憲鶴等［23］報道表明，狂犬病病毒地鼠腎細胞適應(yīng)株3aG G蛋白序列共含1 575個核苷酸，編碼624個氨基酸，4種核苷酸的組成分別為：A占27%、T占26%、C占22%、G占25%。3aG株的G蛋白核苷酸序列與巴斯德株（PV株）和國際標準攻擊毒株（CVS株）的核苷酸序列同源性分別為91.17%和89.44%，氨基酸序列同源性分別為89.89%和86.83%；G蛋白膜外區(qū)部分特征抗原位點的比較顯示，3aG株、PV株及CVS株有高度同源性。白憲鶴等［24］對N蛋白等進行了序列測定，結(jié)果顯示，3aG株N蛋白全長含1 352個核苷酸，與CVS株的同源性為91.95%。2011年，郭秀俠等［25］將3aG株接種至Vero細胞中進行適應(yīng)性傳代，其中一項關(guān)于G蛋白序列的研究結(jié)果顯示，aGV株與3aG、PV、CTN-1、CVS株和街毒株G蛋白基因序列同源性分別為99%、92%、84%、91%、84%。

2.2全基因序列的基因特性 李加等［26］于2013年進行了aG株全基因組測序，將aG株全基因組RNA分為8段進行RT-PCR分段擴增，其中，基因組5′端采用5′RACE法，PCR擴增產(chǎn)物克隆至載體pGEM-T中，測序拼接獲得病毒的全基因序列；用DNAstar軟件包中相應(yīng)的軟件對基因的全序列進行分析，并與國內(nèi)外主要狂犬病疫苗生產(chǎn)株進行了同源性分析和主要抗原位點的比較。結(jié)果表明，aG株的基因組序列長為11 925 bp（GenBank登錄號為：JN234411），屬于Ⅰ型狂犬病病毒；aG株與人用或獸用狂犬病疫苗株（如PV2601、PM1503、SAG2、ERA、SAD B19、Flury-LEP、HEP-Flury和SRV9）全基因組的同源性分別為91.2%、90.0%、91.1%、91.3%、91.1%、90.5%、87.9%和87.9%。

趙雅靜等［27］在2016年也進行了aG株的全基因測序，并根據(jù)疫苗生產(chǎn)工藝進行了傳代。提取主種子批、工作種子批和疫苗原液RNA，用RT-PCR技術(shù)擴增全基因組；將目的基因片段克隆至載體pGEM-T中。應(yīng)用DNAStar軟件包分析aG株與GenBank中的4aGV參考株（JN234411）及18株基因型Ⅰ型狂犬病病毒參考株的同源性，結(jié)果表明，aG株全基因組由11 925個核苷酸組成，編碼3 600個氨基酸。疫苗原液和主種子批全基因組核苷酸和氨基酸序列同源性均為100%，工作種子批和主種子批核苷酸及序列氨基酸序列同源性分別為99.97%和99.92%；aG株和4aGV全基因組核苷酸及氨基酸序列同源性為99.97%和99.9%，其與18株基因型Ⅰ參考株核苷酸和氨基酸序列同源性分別為84.2%～97.6%和93.7%～98.3%；aG株和4aGV參考株全基因組氨基酸序列高度保守，主要功能區(qū)未發(fā)生變化?？袢〔《綼G株在實驗室長期生產(chǎn)和傳代過程中，全基因組遺傳特性穩(wěn)定。

3 免疫保護效果

原代地鼠腎細胞培養(yǎng)aG株滅活疫苗經(jīng)原代疫苗、Al（OH）3佐劑疫苗、濃縮疫苗、濃縮純化疫苗、濃縮純化去佐劑疫苗等一系列工藝改進和升級，自1984年以來，年劑量已超過100萬人，總體預(yù)防效果良好，不良反應(yīng)較輕，未見過敏性腦脊髓炎反應(yīng)發(fā)生，但存在一些免疫失敗病例，其原因可能是疫苗未濃縮、抗原量及效價較低（效價一般僅有1.3 IU/劑，未達到WHO規(guī)定標準，即≥2.5 IU/劑）導致的。為進一步提高疫苗質(zhì)量，1993年以后，開始批量生產(chǎn)濃縮疫苗，其生產(chǎn)工藝與原疫苗相似，最終疫苗原液通過10萬或30萬分子量的截留膜濃縮3~5倍。疫苗年產(chǎn)量達500萬~600萬劑，以滿足暴露后的需要，全國狂犬病病例從70年代的約每年6 000例下降至每年200～400例［28-29］。

3.1暴露前免疫保護 由于未純化疫苗中含有一定量的雜質(zhì)蛋白，大規(guī)模接種后一般過敏反應(yīng)時有發(fā)生，濃縮疫苗的不良反應(yīng)較為嚴重，如注射部位疼痛、大面積紅腫、全身性蕁麻疹、過敏性紫癜、血管神經(jīng)性水腫等，也出現(xiàn)了休克、昏迷等嚴重不良反應(yīng)，嚴重不良反應(yīng)發(fā)生率為5%～10%，危及患者生命［30］。分析不良反應(yīng)發(fā)生的原因主要是由于疫苗生產(chǎn)過程中殘留了異種蛋白，如小牛血清、豚鼠腦組織、原代地鼠腎細胞蛋白等，因此需對狂犬病疫苗進行純化，以去除異種蛋白，降低不良反應(yīng)發(fā)生率。純化方法為：將原液經(jīng)層析或醋酸鋅沉淀后采用Sepharose凝膠柱層析或DEAE-Sepharose-CI-6B離子交換法純化，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾滅菌，有些廠家將傳統(tǒng)的福爾馬林滅活病毒改為1∶4 000β-丙內(nèi)酯，最后加入Al（OH）3。

法國維爾博狂犬病疫苗及國產(chǎn)原代地鼠腎細胞生產(chǎn)的aG株狂犬病疫苗接種人體后均無異常反應(yīng)。國產(chǎn)aG株狂犬病疫苗免疫3針后，低熱、發(fā)紅、硬結(jié)、皮疹等副作用發(fā)生率為0～9.7%，維爾博疫苗為0～9.1%，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；國產(chǎn)aG株狂犬病疫苗與維爾博疫苗免疫3次后抗體陽轉(zhuǎn)率均達100%，抗體效價分別為9.8～24.2和9.7～17.8 IU/mL，兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）［30］。用Vero細胞生產(chǎn)的aG株滅活疫苗已于1999年獲得我國新藥證書并投產(chǎn)，規(guī)格為1 mL/劑，均為加佐劑液體劑型。國內(nèi)某廠家生產(chǎn)的Vero細胞疫苗按3、5針免疫程序接種348名志愿者，未發(fā)生中、重度不良反應(yīng)；注射3次（27人）或5次（30人）后第14天，抗體陽轉(zhuǎn)率達100%，抗體滴度分別為2.89和4.42 IU/mL，接種法國維爾博狂犬病疫苗3次（24人）后抗體陽轉(zhuǎn)率也達100%，抗體滴度為2.13 IU/mL，兩種疫苗差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）［30］。國內(nèi)另一廠家生產(chǎn)的Vero細胞狂犬病疫苗免疫311人，未發(fā)生中、重度不良反應(yīng)；注射5次（34人）后第14天，所有抗體陽轉(zhuǎn)率均為100%，抗體滴度為3.1 IU/mL［30］。

3.2暴露后免疫保護 用原代地鼠腎細胞制備aG株狂犬病疫苗，在河南、廣西、江蘇、河北等狂犬病流行區(qū)進行暴露后免疫觀察，接種了301例暴露后患者，其中85例為輕傷，216例為中、重度咬傷或抓傷患者。對輕傷患者按14次注射方案進行皮下免疫；中度損傷患者于第0、7、14天分別進行1次肌肉注射；重度損傷患者于第0、7、14、24和34天分別進行1次肌肉注射。同時對傷人的可疑狂犬病動物進行病理活檢，結(jié)果表明，85例輕度損傷患者中25例確診為狂犬病街毒感染，216例中、重度患者中72例為狂犬病街毒感染，72例患者中有21例為嚴重咬傷，在第1次接種疫苗時同時注射了抗狂犬病病毒血清。免疫后7～36個月內(nèi)未發(fā)生狂犬病，表明注射狂犬病疫苗進行暴露后免疫治療是可行的［4，31］。另外，原代地鼠腎細胞制備aG株狂犬病疫苗的效果在瘋狼集中咬傷患者的治療中也得到了證實，該次事件中瘋狼共咬傷31人，27例患者在1~2 d內(nèi)注射了該疫苗，其中13例嚴重咬傷者合并注射了抗狂犬病病毒血清，隨后2年半內(nèi)，27例患者全部得到保護；其他4例患者中，3例頭部重傷，但僅注射了疫苗，另1例未進行疫苗全程免疫，均于被咬傷后22~51 d患典型狂犬病導致死亡［32］。

4 小結(jié)

1980年以前，我國生產(chǎn)和使用的狂犬病疫苗是用石碳酸滅活的山羊腦組織懸液疫苗，該疫苗接種后不良反應(yīng)嚴重，尤其是腦組織引起的變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎，免疫效果也較差。為解決這些問題，由多家機構(gòu)合作，于1965年開始使用狂犬病病毒北京株通過原代地鼠腎細胞適應(yīng)傳代，獲得aG株，并成功研制了原代地鼠腎細胞培養(yǎng)的狂犬病病毒滅活疫苗，該疫苗是通過采用福爾馬林滅活，并加入Al（OH）3佐劑制備而成，于1980年取得生產(chǎn)許可證，開始正式生產(chǎn)和應(yīng)用，并替代羊腦疫苗［6］，經(jīng)一系列產(chǎn)業(yè)升級和改造后，目前仍在我國疫苗市場銷售和使用，2015—2019年的批簽發(fā)量分別為80萬、80萬、100萬、120萬和63萬人份［33］。自2005年人用狂犬病疫苗實行批簽發(fā)制度以來，陸續(xù)有多家疫苗企業(yè)開始研發(fā)、生產(chǎn)Vero細胞培養(yǎng)aG株的人用狂犬病疫苗，2015—2019年的批簽發(fā)量分別為635萬、710萬、998萬、600萬和186萬人份［33］，為我國狂犬病的預(yù)防和控制發(fā)揮了積極作用。