人冠狀病毒及其疫苗的研究進展

王俊麗，賈金倫綜述，盧榮華審校

1.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng) 453007；2.河南師范大學水產(chǎn)學院，河南新鄉(xiāng) 453007

冠狀病毒（coronavirus，CoV）是自然界廣泛存在的一類病毒家族，其宿主范圍覆蓋了鳥類、哺乳類和人類，其中鳥傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis coronavirus，TGEV）等曾多次造成全球畜牧業(yè)的重大損失。早期的人冠狀病毒（human coronavirus，HCoV）由于感染后臨床表現(xiàn)較輕被人們所忽視，2002—2003年暴發(fā)的嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和2012年暴發(fā)的中東呼吸綜合征（Middle-East respiratory syndrome，MERS），由于高致死率及缺乏特效藥物和疫苗，引起了全球范圍內(nèi)的傳播；新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）在短短幾個月內(nèi)席卷了全球200多個國家和地區(qū)，至2020年10月9日，已造成3 600多萬人感染，105.6萬多人死亡［1］，不僅對全球公眾健康構(gòu)成了嚴重威脅，并阻礙了社會經(jīng)濟全面發(fā)展。另外，在野生動物身上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了SARS和MERS相關CoV，提示未來可能還會暴發(fā)類似HCoV感染的傳染病［2］。本文就HCoV的致病性及HCoV疫苗的研究進展作一綜述。

1 HCoV的致病性

HCoV主要造成呼吸道感染及引起胃腸炎和神經(jīng)障礙。7種已知的HCoV中，HCoV-229E、HCoVOC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1在人群中普遍存在并呈全球性分布，在呼吸系統(tǒng)疾病的高發(fā)季（冬春季）共流行，是引起咽喉炎和普通感冒的病毒之一，在免疫功能完善的正常人群中主要引起輕微的上呼吸道癥狀，但對免疫功能低下的嬰幼兒及老年人可能引起重癥感染［3］。HCoV-229E和HCoV-OC43于20世紀60年代分離自普通感冒患者，其病毒特性及對人類的致病力基本類似，10%～30%的普通感冒與其有關，幾乎100%的兒童在幼年早期感染過，主要表現(xiàn)為自限性上呼吸道感染，臨床過程輕微，極少有后遺癥，感染后的潛伏期為2～4 d［4］。HCoV-NL63于2004年從荷蘭1例患毛細支氣管炎的嬰兒體內(nèi)分離，感染人群以嬰幼兒為主，感染率約2%，主要引起小兒急性下呼吸道感染，如哮喘、毛細支氣管炎等，臨床癥狀相對較輕；成人免疫缺陷患者對HCoV-NL63也較易感［5］。HCoV-HKU1由香港大學學者WOO等于2005年從1例71歲男性肺炎患者的鼻咽抽吸物中分離獲得，通常引起較輕的呼吸道感染，多數(shù)為自限性，但有基礎疾病的患者感染后可導致疾病進一步加重［5］。SARS-CoV和MERS-CoV是高致病性CoV，可感染人下呼吸道并引起重癥呼吸綜合征。至2003年8月，全球累計SARS-CoV感染病例共8 422例，涉及32個國家和地區(qū)，死亡919例，病死率近11%，病毒學及流行病學的研究結(jié)果表明，SARS-CoV可能是幾種動物病毒在動物-人種間跳躍感染產(chǎn)生；MERS于2012暴發(fā)于沙特阿拉伯、阿聯(lián)酋等中東地區(qū)，隨后波及全球26個國家和地區(qū)，目前仍有散在發(fā)病，截至2020年1月，全球共報告2 519例感染病例，其中866例死亡，病死率近35%［6-7］。2019-nCoV主要通過呼吸道飛沫、氣溶膠和接觸傳播，由其引發(fā)的COVID-19臨床表現(xiàn)為發(fā)燒、干咳、呼吸困難，嚴重時可導致SARS、腎衰竭甚至死亡。基于保守型非結(jié)構(gòu)蛋白序列分析結(jié)果表明，2019-nCoV屬于與嚴重急性呼吸綜合征相關的新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronaviruses，SAR-Sr-CoV），與SARS-CoV基因組序列具有79.5%相似性，并識別相同的細胞受體——血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensinconverting enzyme 2，ACE2）［8］，因此又被稱為SARSCoV-2。2019-nCoV的致病力弱于SARS-CoV和MERSCoV，但傳染力強，傳播迅速且潛伏期長。7種已知HCoV的特征及致病性見表1。

表1 7種HCoV的主要特性Tab.1 Main characteristics of seven kinds of HCoV

2 HCoV疫苗的研發(fā)

在已發(fā)現(xiàn)的7種HCoV中，SARS-CoV、MERSCoV和2019-nCoV具有較強的致病性，對人類公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了極大威脅，因此針對這些病毒的相應疫苗進行了研發(fā)，其中，已有2個SARS相關疫苗完成了Ⅰ期臨床試驗；MERS相關疫苗有1個已完成Ⅱ期臨床試驗，1個完成了Ⅰ期臨床試驗，另有幾個進入了Ⅰ期臨床試驗階段［9］。由于2019-nCoV與SARS-CoV和MERS-CoV有較高的同源性，基于SARS和MERS疫苗的多年研究為COVID-19疫苗的開發(fā)提供了寶貴的經(jīng)驗。截至2020年9月28日，WHO公布全球共有191個COVID-19疫苗研發(fā)項目，幾乎涵蓋了疫苗研究的所有類型，其中40個已進入臨床試驗，10個已進入Ⅲ期臨床試驗（包括4個病毒載體疫苗、3個滅活疫苗、2個mRNA疫苗和1個重組蛋白亞單位疫苗）［10］，其中有4個為我國自主研發(fā)。

2.1H C o V基因重組疫苗 在CoV的所有非結(jié)構(gòu)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白中，結(jié)構(gòu)蛋白S和N的免疫原性最好［11］。SARS-CoV N蛋白DNA疫苗可引起小鼠的體液和細胞免疫反應［12］，利用In silico方法也預測出MERS-CoVN蛋白具有誘導中和抗體和T細胞反應的表位［13］。但動物保護性實驗表明，抗SARSCoV N蛋白的血清不含特異性中和抗體，因此基于SARS-CoV N蛋白的疫苗不僅不能保護小鼠抵抗同種或異種病毒的攻擊，還會導致肺部因嗜酸性粒細胞浸潤引起的免疫病理損傷［14］。研究表明，SARS-CoV和MERS-CoV的S蛋白均可在小鼠等模型動物體內(nèi)產(chǎn)生細胞免疫應答和保護性中和抗體［15-16］，且均在Ⅰ期臨床試驗中可檢測到疫苗誘導的體液和細胞免疫反應［9，17］。因此，除全病毒滅活疫苗和減毒活疫苗外，目前在研的各種HCoV疫苗多是基于S蛋白的基因重組疫苗，其中全長S蛋白、S1亞單位及S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域（RBD-S）均含有中和抗原表位，可刺激機體產(chǎn)生中和抗體和保護性免疫反應。全長S蛋白和S1亞單位含有非中和抗原表位，因此免疫機體后再遇到同型病毒可能會導致機體的免疫病理反應，如肺部嗜酸性粒細胞浸潤或抗體依賴的感染增強作用（antibody-dependent enhance-ment，ADE），因此，不含非中和抗原表位的RBD-S成為許多CoV重組疫苗研究中的首選抗原［18］。利用基因測序信息和免疫信息學技術已快速鑒定了2019-nCoV的T、B細胞表位，其中一些表位在2019-nCoV和SARS-CoV之間高度保守，以這些保守的表位序列為靶標所設計的疫苗可能會對二者產(chǎn)生交叉保護作用［19］。

2.1.1重組蛋白亞單位疫苗 重組蛋白亞單位疫苗是采用表達系統(tǒng)在體外表達抗原蛋白，分離純化后直接將抗原蛋白作為疫苗。由于成分單一，其免疫原性較弱，通常僅產(chǎn)生體液免疫反應，因此需要在疫苗中添加合適的佐劑。以全長S蛋白和RBD-S為抗原的SARS-CoV重組蛋白疫苗均可誘導小鼠產(chǎn)生高滴度中和抗體［20-21］，MERS-CoV的重組S蛋白疫苗在實驗動物體內(nèi)也誘導出了較高水平的中和抗體［22］。目前2019-nCoV的重組蛋白亞單位疫苗已有13個進入臨床試驗［10］，見表2，其中Novavax公司開發(fā)的NVX-CoV2373已進入Ⅲ期臨床試驗，安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司和中科院微生物研究所聯(lián)合開發(fā)的RBD-sc-dimer亞單位疫苗進入了Ⅱ期臨床試驗［10］。NVX-CoV2373是以Matrix M1為佐劑的2019-nCoV重組S糖蛋白納米顆粒疫苗，該疫苗在嚙齒類和非人靈長類體內(nèi)誘導出了較高的體液和細胞免疫反應，并能阻斷病毒S蛋白與人ACE2的結(jié)合；在Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗中，該疫苗不僅顯示出較高的安全性，還誘導出了高于COVID-19患者恢復期血漿的抗體水平［23］。RBD-sc-dimer是將兩條RBD-S單鏈以二硫鍵串連在一起形成的二聚體，克服了傳統(tǒng)單體形式RBD-S疫苗免疫原性低的問題，刺激模型小鼠產(chǎn)生的中和抗體滴度可高于傳統(tǒng)RBD-S疫苗10～100倍，且這種設計在SARS、MERS和COVID-19疫苗中均適用［24］。

表2 已進入臨床試驗的COVID-19重組蛋白亞單位疫苗Tab.2 Recombinant protein subunit vaccines against COVID-19 in clinical trials

2.1.2重組載體疫苗 重組載體疫苗是利用基因工程技術將抗原基因?qū)霚p毒或無毒的活病毒或活細菌（載體），接種宿主后在體內(nèi)表達目的抗原，刺激機體產(chǎn)生免疫反應。與重組亞單位疫苗相比，重組載體疫苗可誘導更強的細胞免疫反應。常用的病毒載體有痘病毒、皰疹病毒、腺病毒等DNA病毒及減毒的流感病毒和黃病毒等RNA病毒，非致病性乳酸菌是最有應用前景的細菌載體。HCoV S蛋白的病毒載體疫苗已得到廣泛研究，其中以減毒的人副流感病毒3型相關牛病毒（bovine counterpart of human parainfluenza virus 3，BHPIV3）為載體的SARS-CoV全長S蛋白疫苗（BHPIV3/SARS-S）和以狂犬病病毒（rabis virus，RV）為載體的SARS-CoV全長S蛋白疫苗（RV/SARS-S）在實驗動物中均誘導出了保護性免疫反應［25-26］。以英國牛津大學研究人員構(gòu)建的復制缺陷型黑猩猩腺病毒（Chimpanzee Adenovirus-Oxford University#1，ChAdOx1）為載體的MERS-CoV全長S蛋白疫苗（ChAdOx1 MERS）在人DPP4轉(zhuǎn)基因（hDPP4 Tg+）小鼠和天然傳播模型單峰駝中均誘導出了有效的保護性免疫反應，Ⅰ期臨床試驗證明，該疫苗具有良好的安全性和可耐受性，且單劑量免疫即可引起抗MER-CoV的體液和細胞免疫反應［27-29］。

目前，已有9個2019-nCoV病毒載體疫苗進入臨床試驗，見表3，其中4個處于Ⅲ期［10］，分別為康希諾生物股份公司與北京生物技術研究所聯(lián)合研制的Ad5-nCoV、牛津大學和阿斯利康（AstraZeneca）聯(lián)合開發(fā)的ChAdOx1 2019-nCoV、俄羅斯Gamaleya研究所的Adeno-based（rAd26-S+rAd5-S）及楊森制藥的Ad26COVS1。Ad5-nCoV是將2019-nCoV的S蛋白基因和纖溶酶原激活劑（plasminoen activator）基因的信號肽部分一起克隆入非復制型人Ad5（缺乏E1和E3基因）基因組構(gòu)建而成，在以≥18歲健康成年人為研究對象的Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗中，誘導出了較強的中和抗體反應和T細胞免疫反應，并顯示出較好的安全性［30-31］；給小鼠和雪貂鼻內(nèi)接種1劑Ad5-nCoV，可保護免疫動物免受野生型2019-nCoV感染，提示該疫苗不僅有較好的免疫原性，且經(jīng)黏膜途徑接種是可行的［32］。ChAdOx1 2019-nCoV是以ChAdOx1為載體，表達2019-nCoV的全長S蛋白，接種小鼠和獼猴后誘導平衡的TH1/TH2體液和細胞免疫反應，可保護受2019-nCoV攻擊的免疫動物不發(fā)生肺炎［33］；在以18~55歲健康成年人為研究對象的早期臨床試驗也顯示出較好的安全性，且誘導出了較強的體液和細胞免疫反應［34］。Adeno-based（rAd26-S+rAd5-S）是將rAd26-S和rAd5-S聯(lián)合使用，2種疫苗均表達2019-nCoV的全長S蛋白，在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗的第一階段證明了rAd26-S和rAd5-S分別單獨接種的安全性和可耐受性，在第二階段先以rAd26-S初免志愿者，21 d后以rAd5-S進行加強免疫，所有接種者均產(chǎn)生了較強的體液和細胞免疫反應［35］。

表3 已進入臨床試驗的COVID-19病毒載體疫苗Tab.3 Virus-vector vaccines against COVID-19 in clinical trials

2.1.3重組病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）疫苗 VLPs疫苗是由病毒的1個或多個結(jié)構(gòu)蛋白組成的不含病毒基因組的空心顆粒，因此不能自主復制，不具有感染性，較滅活疫苗或減毒活疫苗更安全，同時較亞單位疫苗或核酸疫苗的免疫原性強。由SARS-CoV S蛋白與流感病毒M1蛋白或小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）的E、M、N蛋白組成的嵌合型VLPs，均可誘導小鼠產(chǎn)生針對SARS-CoV S蛋白的保護性免疫應答［36-37］。MERS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白相關的VLPs在小鼠和獼猴體內(nèi)均誘導出了較強的體液和細胞免疫反應，并可保護免疫動物不受MERS-CoV的侵染［38-39］。利用Vero E6細胞同時表達2019-nCoV的4種結(jié)構(gòu)蛋白（S、M、N和E），可自動組裝成穩(wěn)定的VLPs［40］；將2019-nCoV的3種結(jié)構(gòu)蛋白（S、M和E）mRNA分別用脂質(zhì)納米粒包封后轉(zhuǎn)染HEK 293A細胞，表達的目的蛋白可自動組裝成VLPs，并分泌至細胞外，將這3種mRNA按一定比例混合制成聯(lián)合mRNA疫苗，免疫小鼠后產(chǎn)生的體液免疫反應遠高于單一的S蛋白mRNA疫苗［41］。2019-nCoV RBD-S與乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）表面抗原共表達而形成的VLPs疫苗，目前已進入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗［10］。

2.2核酸疫苗 核酸疫苗包括DNA疫苗和mRNA疫苗，DNA疫苗由攜帶目的抗原基因的重組質(zhì)粒組成，mRNA疫苗則使用可編碼目的抗原的mRNA作為疫苗。核酸疫苗可在宿主體內(nèi)表達抗原蛋白，引起免疫反應。SARS-CoV S蛋白的DNA疫苗不僅可誘導小鼠產(chǎn)生保護性免疫應答，在Ⅰ期臨床試驗中也誘導出了體液和細胞免疫反應［15，17］。美國Invivo公司通過專有密碼子優(yōu)化技術并添加人免疫球蛋白E（IgE）信號肽序列制備的MERS-CoV S蛋白DNA疫苗（INO-4700），提高了S蛋白的分泌表達和免疫原性，在小鼠、駱駝和獼猴中均誘導出了保護性免疫反應，在肺部感染模型中能夠保護獼猴不受MERS-CoV感染［16］，該疫苗也是首個進入Ⅰ期臨床的MERS疫苗，其臨床試驗結(jié)果顯示，大部分受試者能夠檢測到疫苗誘導的體液和細胞免疫反應，僅產(chǎn)生輕微的自限性不良反應［9］；在此基礎上開發(fā)的表達2019-nCoV S蛋白的DNA疫苗（INO-4800）在多種動物模型中顯示出良好的免疫原性［42］，該疫苗目前已進入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗。除INO-4800外，還有多個COVID-19 DNA疫苗和mRNA疫苗進入臨床試驗，見表4，其中2個mRNA疫苗進入Ⅲ期臨床試驗（美國國家過敏癥和傳染病研究所與Moderna公司合作研發(fā)的mRNA-1273和德國Bio-NTech公司與美國Pfizer公司聯(lián)合研制的BNT-162b1）［10］。mRNA-1273是將編碼nCoV-19融合前S蛋白的mRNA以新型脂質(zhì)納米粒（Lipid nanoparticles，LNPs）包裹而成，接種該疫苗的小鼠和獼猴可迅速清除由鼻腔進入上、下呼吸道的2019-nCoV；Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗顯示，該疫苗有較好的安全性和可耐受性，產(chǎn)生的中和抗體類似恢復期患者的血清抗體水平，且在老年群體中也產(chǎn)生了較好的免疫反應［43］。BNT162b1是由核苷修飾、LNPs為載體的脂溶性納米制劑，可編碼三聚化的2019-nCoV RBD-S，在早期臨床試驗中證明，具有良好的安全性和可耐受性，且適用于65～85歲的老人，肌肉注射第2劑后14 d，接種者的平均中和抗體水平達到恢復期患者的1.9～4.6倍，并可誘導出顯著的TH1型細胞免疫反應［44-45］。

表4 已進入臨床試驗的COVID-19核酸疫苗Tab.4 Nucleic acid vaccines against COVID-19 in clinical trials

2.3全病毒滅活疫苗 全病毒滅活疫苗抗原屬性與天然病毒一致，可刺激機體產(chǎn)生針對病毒的多種蛋白和抗原表位的保護性抗體，缺點是可能會引起ADE作用。SARS和MERS全病毒滅活疫苗均在實驗動物中誘導出了高效價的血清中和抗體，并可保護動物抵抗同源病毒株的攻擊［46-47］。Ⅰ期臨床試驗也證明了SARS滅活疫苗刺激人體產(chǎn)生體液免疫的效力［48］。最早獲批附條件上市申請的3款COVID-19滅活疫苗的生產(chǎn)企業(yè)，分別是國藥集團中國生物北京生物制品研究所有限責任公司（2020年12月31日獲批上市，HB02株）［49］、北京科興中維生物技術有限公司（2021年2月6日獲批上市，CZ株）［50］及國藥集團中國生物武漢生物制品研究所有限責任公司（2021年2月25日獲批上市，WIV04株）［51］。3款滅活疫苗在實驗動物中均顯示出較強的免疫原性，可保護非人靈長類動物抵抗強致病性2019-nCoV毒株的攻擊，且未出現(xiàn)抗體依賴的ADE現(xiàn)象；Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期臨床試驗中未發(fā)現(xiàn)嚴重不良事件，接種后產(chǎn)生了顯著的中和抗體反應［52-58］。

2.4減毒活疫苗 減毒活疫苗可在機體內(nèi)存活一定時間，誘導強烈且持久的體液和細胞免疫應答，特別是可誘導黏膜免疫反應，因此，雖然可能存在毒力回復的風險，減毒活疫苗仍是預防性疫苗的理想選擇。目前，HCoV減毒活疫苗的研究主要是采用現(xiàn)代遺傳學技術除去或失活病毒的致病基因從而獲得減毒株。已使用的目標基因有結(jié)構(gòu)蛋白中的E蛋白、部分非結(jié)構(gòu)蛋白（non-strudare protein，NSP）和部分輔助蛋白，均處于實驗室研究階段，尚無HCoV減毒活疫苗進入臨床試驗。E蛋白或NSP14蛋白基因缺失的SARS-CoV致病力均顯著降低，免疫動物后可誘導高滴度中和抗體和抵抗病毒攻擊的免疫保護作用［59-60］。NSP16突變的SARS-CoV和MERS-CoV突變株均表現(xiàn)為對Ⅰ型干擾素敏感，并可對幼年小鼠提供抗野生型病毒感染的保護力［61-62］。刪去輔助基因ORF3、4和5的MERS-CoV在動物體內(nèi)表現(xiàn)為致病力下降，其誘導產(chǎn)生的中和抗體，可保護hDPP4Tg+小鼠抵抗野生型MERS-CoV的攻擊［63］。有3個COVID-19減毒活疫苗正在進行臨床前研究，均是采用密碼子去優(yōu)化技術對其毒力基因進行修飾，但實驗結(jié)果尚未公布［10］。

3 小結(jié)

由于CoV的自然宿主在鳥類和哺乳類動物中廣泛存在，不同物種間的CoV又可能存在交叉?zhèn)鞑?，使可適應新宿主和不同感染部位的新型CoV不斷出現(xiàn)，在此過程中人類也不斷面臨著新型HCoV的感染風險［2］。因此，還應全面研究不同來源CoV的生物學特性、感染致病機制、對不同環(huán)境的適應性及在人和動物體內(nèi)引起的免疫反應的差異，以便盡快解決目前存在的HCoV對人類的傷害和應對可能再次出現(xiàn)的新型HCoV對人類的威脅。