PD-1/PD-L1與膿毒癥的免疫紊亂

張堯堯，張 永，李 言

(1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽 蚌埠 233000； 2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，安徽 蚌埠 233000)

膿毒癥(sepsis)的發(fā)病率逐年上升，已成為主要的公眾健康問題之一，也是全球重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)非冠脈性疾病危重和死亡的主要原因，免疫紊亂是其最顯著特點(diǎn)，其中持續(xù)的免疫抑制更是成為當(dāng)前新的研究熱點(diǎn)[1]。在膿毒癥住院患者中，病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)及受損或壞死組織來源的損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)被宿主模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別，啟動(dòng)相應(yīng)的免疫反應(yīng)。而適應(yīng)性免疫系統(tǒng)可以通過控制或局限化損傷過程來保持免疫平衡狀態(tài)。這種促進(jìn)和拮抗的調(diào)節(jié)異常時(shí)出現(xiàn)控制失衡，甚至引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”(cytokine storm)[2]，誘發(fā)過度炎癥反應(yīng)。雖然部分膿毒癥患者可以度過最初的炎癥風(fēng)暴階段，但若免疫抑制持續(xù)存在將進(jìn)一步增加醫(yī)院獲得性感染和病原體再活化的風(fēng)險(xiǎn)。而這種膿毒癥患者免疫抑制的重要機(jī)制就是程序性死亡受體1(programmed cell death protein-1,PD-1)與程序性死亡受體-配體1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)途徑，其與T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、MPS的活化增殖受到抑制及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和MDSC等數(shù)量的增加密切相關(guān)，PD-1/PD-L1對(duì)膿毒癥患者免疫狀態(tài)以及疾病發(fā)展中的作用引起學(xué)界高度關(guān)注，但對(duì)于PD-1/PD-L1檢測(cè)作為免疫生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的臨床價(jià)值并未能達(dá)成共識(shí)，尤其當(dāng)免疫檢查點(diǎn)阻斷劑的相關(guān)抗體治療試驗(yàn)及結(jié)果并未最終完成時(shí)[3-4]。

1 PD-1/PD-L1

PD-1(CD279)是CD28/CTLA-4/ICOS共刺激受體家族中對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫的關(guān)鍵成員，負(fù)責(zé)傳遞負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)。PD-1由PDCD1基因編碼的單體I型跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括胞外結(jié)構(gòu)域——免疫球蛋白可變區(qū)(IgV)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)，來共同執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。PD-1屬于CD28家族成員[5-6]，當(dāng)胞外段與其配體PD-L1結(jié)合后，胞內(nèi)段免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM)和轉(zhuǎn)換基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif,ITSM)主要發(fā)揮免疫抑制作用。PD-1與PD-L1的結(jié)合可以導(dǎo)致PD-1胞質(zhì)尾部酪氨酸磷酸化，募集酪氨酸磷酸酶(SHP-2)直接拮抗T細(xì)胞受體(TCR)和CD28活化信號(hào)[7]。在癌癥免疫中發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞表面PD-L1踩下“免疫剎車”，可以抑制免疫細(xì)胞活化，臨床試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)該分子對(duì)于腫瘤具有逃避免疫攻擊的作用[8-9]。由于PD-L1在T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)、巨噬細(xì)胞(M)及其他非造血細(xì)胞上廣泛表達(dá)，而PD-L2表達(dá)受限，主要在DCs、M和B細(xì)胞上表達(dá)[10]，因此PD-1/PD-L1作為免疫診療的潛在靶點(diǎn)得到了更多的研究。Herbst等[11]研究發(fā)現(xiàn)PD-1抗體在晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的二線治療中優(yōu)于化學(xué)治療，且首次證實(shí)PD-L1表達(dá)水平可作為生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)PD-1抗體療效；但與此同時(shí)，也會(huì)因釋放自身反應(yīng)性T細(xì)胞導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病[12]。因此，PD-1/PD-L1在機(jī)體免疫中作用較復(fù)雜，了解其在膿毒癥中的免疫機(jī)制尤其重要。

2 膿毒癥與免疫

免疫炎癥紊亂是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的核心機(jī)制，相關(guān)認(rèn)識(shí)正在不斷深化。在正常情況下，所有活化的T細(xì)胞均表達(dá)PD-1，其作為一個(gè)“天然剎車”可以平衡T細(xì)胞的過度激活反應(yīng)，參與免疫耐受。但在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中，PD-1/PD-L1通路會(huì)對(duì)固有免疫及適應(yīng)性免疫產(chǎn)生損傷，總體上發(fā)揮免疫抑制作用，見圖1。PD-1/PD-L1使中性粒細(xì)胞、DCs、單核細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等產(chǎn)生功能障礙，不僅直接破壞固有免疫系統(tǒng)功能，作為抗原提呈細(xì)胞進(jìn)一步阻礙適應(yīng)性免疫應(yīng)答；PD-1/PD-L1表達(dá)水平的升高還可直接增加T細(xì)胞耗竭和凋亡，增加Treg細(xì)胞的數(shù)量和抑制性功能，負(fù)向調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。簡(jiǎn)言之，PD-1/PD-L1通路在膿毒癥的免疫抑制機(jī)制中作用獨(dú)特。

2.1 PD-1/PD-L1與T淋巴細(xì)胞 PD-1與PD-L1結(jié)合可以引起膿毒癥患者T細(xì)胞耗竭。T細(xì)胞活化需雙重信號(hào)刺激：其一為APCs的MHC-抗原肽識(shí)別TCR，其二為APCs表面的共刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)配體相結(jié)合。這種雙重信號(hào)刺激實(shí)質(zhì)上是一種故障-安全模式。CD28/B7相互作用傳導(dǎo)T細(xì)胞活化信號(hào)，PD-L1、PD-L2與B7-1、B7-2在結(jié)構(gòu)上高度同源，所以又分別被命名為B7-H1和B7-H2，PD-1：PD-Ls通路為抑制T細(xì)胞激活的協(xié)同刺激信號(hào)，一方面參與宿主免疫耐受對(duì)阻止自身免疫性疾病的發(fā)生起到保護(hù)作用；另一方面通過引起T細(xì)胞耗竭而產(chǎn)生免疫抑制。膿毒癥T細(xì)胞耗竭主要表現(xiàn)為T細(xì)胞活化及增殖能力下降、凋亡增加和細(xì)胞因子減少：(1)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Foxp3+Treg)數(shù)量增加，PD-1表達(dá)上調(diào)，同時(shí)APCs表面CD80/86表達(dá)下調(diào)，共同抑制T細(xì)胞活化增殖[13]，并且PD-1+Treg具有協(xié)助微生物逃避免疫監(jiān)視的作用。Foxp3是Treg的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，進(jìn)入外周循環(huán)的原始CD4+T細(xì)胞可以通過TCR和PD-1與APCs上配體結(jié)合誘導(dǎo)其表達(dá)FoxP3，F(xiàn)rancisco等[14]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)缺陷的APCs誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Treg表型轉(zhuǎn)變的能力最弱。(2)T淋巴細(xì)胞表面IL-7R減少，抑制性受體PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3等表達(dá)增加，IFN-γ等細(xì)胞因子分泌減少[15]，PD-1及配體(PD-L1、PD-L2)在眾多導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭的機(jī)制中被認(rèn)為發(fā)揮了關(guān)鍵作用[16-17]。此外，在TCR信號(hào)通路中，PD-1/PD-L1作用于中間分子如PI3K、Akt、ZAK-70和PKC-，從而干擾細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)并阻遏T細(xì)胞的活化與增殖[18]；PD-1/PD-L1軸還可經(jīng)降低IL-2、大B細(xì)胞淋巴瘤抗凋亡因子的合成來間接抑制T細(xì)胞活化、增殖，進(jìn)而促使T細(xì)胞凋亡[19]。PD-1/PD-L1軸的“免疫檢查點(diǎn)阻斷”對(duì)小鼠各種感染性、自身免疫等模型中的T細(xì)胞正向調(diào)控具有重要作用，在小鼠和人類發(fā)生膿毒癥48 h后，就可觀察到PD-1在CD4+和CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)上調(diào)[20]；孔令宇等[21]研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者經(jīng)連續(xù)性腎替代治療(CRRT)好轉(zhuǎn)后，CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平較治療前下降。如上所述，PD-1/PD-L1軸通過直接或間接耗竭T淋巴細(xì)胞抑制膿毒癥患者免疫應(yīng)答，進(jìn)而發(fā)生膿毒性休克(septic shock)甚至死亡。

PI3K：磷酸磷脂酰激酶-3羥激酶；ZAP70：ζ 鏈相關(guān)蛋白激酶70；SHP：酪氨酸磷酸酶。A：PD-1與PD-L1連接，ITSM募集的SHP通過ZAP-70或PI3K通路去磷酸化，抑制下游信號(hào)傳導(dǎo)，使CD4+T 細(xì)胞向Treg、Th2分化增多，CD8+T細(xì)胞耗竭、失能及抗炎因子白介素(IL)-10增加，M向M2分化增多；PD-1/PD-L1抗體、IL-7可以抑制T細(xì)胞耗竭，增加T細(xì)胞活化、增殖。B：中性粒細(xì)胞表面PD-1與內(nèi)皮細(xì)胞表面PD-L1結(jié)合促進(jìn)中性粒細(xì)胞流入肺泡腔。

2.2 PD-1/PD-L1與中性粒細(xì)胞 膿毒癥患者的中性粒細(xì)胞(PMNs)可通過PD-1/PD-L1通路抑制T細(xì)胞活化增殖。這一途徑主要因?yàn)槟摱景Y急性期PD-L1+中性粒細(xì)胞即低密度中性粒細(xì)胞(low-density neutrophils,LDNs)大量增加。Huang等[22]根據(jù)免疫組化區(qū)分PMNs表面PD-1/PD-L1表達(dá)高(PD-L1high)低(PD-L1low)的亞群。Patera等[23]也發(fā)現(xiàn)PD-L1highPMNs表面CD168表達(dá)下降和TNF-α分泌減少，對(duì)于外來微生物的吞噬能力下降。Lomas-Neira等[24]在小鼠間接性急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)模型中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞PD-1與內(nèi)皮細(xì)胞表面PD-L1結(jié)合會(huì)破壞肺內(nèi)皮細(xì)胞(EC)屏障，中性粒細(xì)胞流入肺泡增加，而PD-1/PD-L1基因敲除的小鼠EC屏障改善，支氣管肺泡灌洗液蛋白減少?？傊?，中性粒細(xì)胞PD-1和PD-L1表達(dá)增加與膿毒癥預(yù)后不良密切相關(guān)。

2.3 PD-1/PD-L1與單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng) 單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(mononuclear phagocytic system,MPS)包括單核細(xì)胞、M和DCs，在膿毒癥發(fā)展到晚期免疫抑制階段時(shí)，PD-1/PD-L1軸會(huì)使MPS發(fā)生細(xì)胞功能障礙，細(xì)胞向抑炎表型轉(zhuǎn)化。

2.3.2 PD-1/PD-L1與單核細(xì)胞 單核細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)重要組成部分，感染時(shí)可以向M、DCs轉(zhuǎn)化，而PD-1/PD-L1通路參與調(diào)控單核細(xì)胞的功能。單核細(xì)胞可以通過Shao等[29]研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平可以獨(dú)立預(yù)測(cè)28天死亡率，說明這一指標(biāo)與膿毒癥疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膿毒癥晚期單核細(xì)胞通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)信號(hào)通路抑制促炎因子的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)單核細(xì)胞上PD-L1蛋白表達(dá)上調(diào)，從而發(fā)生免疫抑制[30-31]；其中HIF-1α可以介導(dǎo)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)使單核細(xì)胞發(fā)生功能障礙[32]。但是，單核細(xì)胞和T細(xì)胞的信號(hào)溝通機(jī)制尚需進(jìn)一步了解。

2.3.3 PD-1/PD-L1與DCs DCs是重要的抗原提呈細(xì)胞之一，該細(xì)胞功能障礙在膿毒癥免疫抑制階段起關(guān)鍵作用。TIPE1是腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8(TnFAIP8)家族的新成員，與細(xì)胞死亡有一定關(guān)系。Luan等[33]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TIPE1負(fù)向調(diào)控DCs成熟和活化，TIPE1基因敲除的小鼠中DCs表面CD80、CD86、MHC-II表達(dá)上調(diào)，PD-1、PD-L1表達(dá)下調(diào)，這說明TIPE1基因可能通過PD-1/PD-L1通路發(fā)揮抑制DCs成熟活化及T細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用。DCs受到LPS和TNF-α刺激時(shí)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(CDK5)表達(dá)會(huì)增加，在腫瘤及慢性鼻竇炎中均發(fā)現(xiàn)CDK5參與調(diào)節(jié)免疫抑制基因，CDK5的增加可以上調(diào)DCs上PD-L1的表達(dá)水平[34-35]，但CDK5和PD-L1在膿毒癥中的聯(lián)系尚無結(jié)論?？偠灾琍D-1/PD-L1通路使MPS細(xì)胞功能障礙，直接或間接導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生免疫抑制。

3 抗PD-1/PD-L1療法與膿毒癥

膿毒癥初期機(jī)體受到抗原刺激，APCs表面的CD80/86、MHC-I/II分別與T細(xì)胞表面的CD28、TCR結(jié)合傳遞活化T細(xì)胞的第一及第二共刺激信號(hào)，T細(xì)胞活化增殖并消除外來微生物。但活化后的T細(xì)胞PD-1表達(dá)也會(huì)被激活，PD-1與PD-L1結(jié)合后會(huì)阻遏第二共刺激信號(hào)，誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭及凋亡，使機(jī)體發(fā)生免疫抑制。目前膿毒癥動(dòng)物試驗(yàn)大量展開，當(dāng)下創(chuàng)建膿毒癥模型的兩種常用方法：LPS法和CLP法，動(dòng)物模型通常采用成年大鼠。Huang等[25]研究發(fā)現(xiàn)PD-1基因敲除的大鼠較野生組存活率提高，試驗(yàn)組大鼠M功能正常，細(xì)菌清除率改善，促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生減少。鼠的免疫反應(yīng)能否模擬人類炎癥性疾病(例如膿毒癥)存在爭(zhēng)議，Wakeley等[36]補(bǔ)充了有關(guān)人類患者的試驗(yàn)，通過分析膿毒癥休克患者PD-1表達(dá)模式和細(xì)胞因子圖譜發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞PD-1表達(dá)水平升高與IFN-γ、IL-4等分泌增加呈正相關(guān)，而這些細(xì)胞因子與Th1、Th2反應(yīng)及細(xì)胞因子風(fēng)暴密切相關(guān)，同時(shí)，APACHE II評(píng)分>20分與PD-1過表達(dá)有關(guān)的結(jié)論提示抗PD-1抗體作為膿毒癥的治療策略的可能性。Hotchkiss等[4]針對(duì)31例患有膿毒癥和總淋巴細(xì)胞減少癥(定義為絕對(duì)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)≤1.1×103/μL)的成年患者進(jìn)行了抗PD-1單克隆抗體納武單抗(nivolumab)的1b期平行組隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，雖然臨床觀察患者免疫力改善并不如腫瘤患者明顯，但是鼓舞人心的是這次臨床試驗(yàn)并沒有發(fā)生嚴(yán)重不良事件(SAE)。同期24例成年膿毒癥患者進(jìn)行的抗PD-L1抗體(BMS-936559)試驗(yàn)已經(jīng)結(jié)束，但結(jié)果尚未公布。雖然目前尚無SAE的相關(guān)報(bào)道，但是PD-1/PD-L1通路與膿毒癥治療的有效性和安全性還需更多試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

膿毒癥動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)提示在膿毒癥免疫抑制階段，PD-1/PD-Ls的過表達(dá)導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能受到抑制，從而增加了膿毒癥患者的病死率。PD-1/PD-Ls不僅作用于抗原提呈細(xì)胞與淋巴細(xì)胞，還作用于抗原提呈細(xì)胞之間、免疫細(xì)胞與非免疫細(xì)胞之間，可能通過影響抵抗微生物免疫防御與免疫介導(dǎo)的組織損傷之間的平衡來影響病原體感染的結(jié)局。大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICI)在許多惡性腫瘤中有一定治療效果，且抗PD-1、PD-L1抗體在治療膿毒癥的Ⅰb期臨床試驗(yàn)已經(jīng)開展，PD-1/PD-Ls及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的分子可能成為膿毒癥新的診斷標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。而PD-1/PD-Ls在膿毒癥免疫抑制中的具體作用機(jī)制如PD-1/PD-Ls如何聯(lián)系固有免疫和適應(yīng)性免疫、如何作用于非免疫細(xì)胞、PD-1/PD-Ls下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等許多問題尚不清楚，有待于進(jìn)一步思考和研究。