微小RNA-146a靶向沉默三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出

幸世峰，孫理華，駱小梅

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是影響人群健康的重大疾病。新疆是AS高發(fā)區(qū)域，故該地區(qū)的AS防控面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)［1］。研究表明，AS是一種免疫介導(dǎo)的動(dòng)脈管壁慢性炎癥，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜［2］。血管壁炎癥激活被認(rèn)為是AS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，其中巨噬細(xì)胞扮演著關(guān)鍵角色：一方面巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞是AS斑塊脂質(zhì)條紋期的標(biāo)志；另一方面，巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞在各種促炎因子的刺激下，可分泌大量促炎因子、趨化因子及其他因子，進(jìn)一步加劇斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞聚集、脂質(zhì)蓄積和基質(zhì)降解［3］。因此，抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積（泡沫化）和炎癥因子釋放是防治AS的重要途徑［4］。

巨噬細(xì)胞膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)失衡是泡沫細(xì)胞形成過程中的主要特征。膽固醇流出對(duì)減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積、抑制泡沫細(xì)胞形成和防治AS發(fā)生具有重要意義［5］。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）等膜蛋白是以三磷酸腺苷（ATP）為能源，將細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面，能有效減少細(xì)胞內(nèi)的膽固醇蓄積。而ABCA1又受多種因子調(diào)節(jié)，其中核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號(hào)通路是其最重要的調(diào)節(jié)途徑。在AS部位和纖維斑塊部位均發(fā)現(xiàn)了激活的 NF-κB，而正常血管很少或沒有表達(dá)NF-κB，證實(shí)NF-κB在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，AS越嚴(yán)重，則微小RNA（miR）-146a表達(dá)水平越高，說明miR-146a表達(dá)調(diào)控與AS發(fā)生存在因果關(guān)系［6］。miR-146a是miR-146家族一員，是先天性和適應(yīng)性免疫中細(xì)胞分化和細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)劑，其受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后可通過抑制NF-κB依賴性的兩種銜接蛋白——IL-1受體相關(guān)激酶1（IL-1 receptor-associated kinase 1，IRAK-1）和TNF受體相關(guān)因子 6（TNF receptor related factor 6，TRAF6）而在巨噬細(xì)胞中起到炎癥制動(dòng)作用［7］。但泡沫細(xì)胞miR-146a表達(dá)上調(diào)是否對(duì)ABCA1表達(dá)有抑制作用及是否導(dǎo)致膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)減少而參與AS形成的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。本研究擬通過使用miR-146a mimics及miR-146a inhibits轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，觀察miR-146a對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出和ABCA1表達(dá)的影響，以探討miR-146a在AS發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，以期為AS的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型建立 本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2018年12月—2020年6月。將THP-1細(xì)胞（人單核細(xì)胞株）放置在含10 mmol/L HEPES、10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞到達(dá)對(duì)數(shù)生長期時(shí)（培養(yǎng)24～36 h），采用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/孔并接種于6孔板中，加入含終濃度為100 ng/ml的佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 ml。培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞貼壁、形態(tài)變化并拍照。THP-1細(xì)胞呈單個(gè)圓形懸浮，密度約為5×106/ml，分布均勻，折光度較好。經(jīng)PMA誘導(dǎo)后單個(gè)圓形、懸浮細(xì)胞逐漸形成梭形或不規(guī)則形狀，并有偽足形成的貼壁細(xì)胞，即分化為巨噬細(xì)胞（見圖1）。再采用含50 μg/ml氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，使其吞噬脂質(zhì)形成巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞。

圖1 PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化前后Figure 1 Before and after differentiation of THP-1 cells induced by PMA

1.2 膽固醇流出檢測方法 將巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞分為空白對(duì)照組，培養(yǎng)液中不加任何其他試劑；陽性對(duì)照組，培養(yǎng)液中加入10 μmol/L肝X受體激動(dòng)劑T0901317；陰性對(duì)照組，培養(yǎng)液中加入100 nmol/L ABCA1小干擾RNA（siRNA）；模擬物組，培養(yǎng)液中加入40 nmol/L miR-146a mimics；抑制劑組，培養(yǎng)液中加入40 nmol/L miR-146a inhibits。采用液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測膽固醇流出效率：THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞后，加入3H標(biāo)記的膽固醇（0.5 μCi/ml）共同孵育、標(biāo)記24 h，后采用RPMI 1640培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h。采用液體閃爍液裂解細(xì)胞，收集培養(yǎng)液和裂解的細(xì)胞中3H標(biāo)記的膽固醇含量，并以每分鐘流出計(jì)數(shù)（counts per minute，CPM）表示。膽固醇流出效率=細(xì)胞內(nèi)CPM/（細(xì)胞內(nèi)CPM+培養(yǎng)液中CPM）×100%。

1.3 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù) 將巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞以1×106的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，匯合度達(dá)到80%后分別轉(zhuǎn)染miR-146a mimics（模擬物組）、miR-146a inhibits（抑制劑組）及In-NC（NC組）。48～72 h 后采用胰酶消化收集細(xì)胞，固定，采用Annexin V-APC和7-AAD（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）雙染細(xì)胞。37 ℃溫浴30 min后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，離心5 min，去胰蛋白酶。采用稀釋緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度至5×105個(gè)/ml。取195 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC混合，室溫下反應(yīng)。加入10 μl碘化丙啶（PI，20μg/ml），反應(yīng)10 min后上機(jī)檢測各細(xì)胞水平。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）將巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞分別以5×105個(gè)/孔接種到6孔板并培養(yǎng)至生長對(duì)數(shù)期，按照要求分別加入In-NC（NC組）、miR-146a mimics（模擬物組）、miR-146a inhibits（抑制劑組）、miR-146a mimics+ NF-κB抑制劑（模擬物+PDTC組）、miR-146a inhibits+NF-κB抑制劑（抑制劑+PDTC組），然后經(jīng)Li-pofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后加入Trizol消化各組細(xì)胞，按照TRIzol Reagent（Invitrogen公司，USA）說明書提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度。采用TransScript? One-Step RT-PCR和TransScript? miRNA First-Strand cDNA Synthesis（北京全式金生物工程有限公司）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。再行熒光定量PCR擴(kuò)增基因片段，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共45個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算NF-κB通路p65、p50及ABCA1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 Western blotting法 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后采用含0.1% PMSF的RIPA裂解液消化、收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。每組取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將蛋白電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。使用ABCA1、NF-κB和β-actin一抗（1∶500稀釋），4 ℃孵育過夜；再加入標(biāo)記IRDye800的二抗（1∶2 000在PBS中稀釋），4 ℃孵育過夜。采用TBST洗滌后，紅外熒光成像系統(tǒng)（Rockland）掃描分析NF-κB通路p65、p50及ABCA1的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 3'UTR熒光素酶報(bào)告基因檢測 通過RT-PCR從巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞RNA中擴(kuò)增ABCA1 3'UTR片段，并定向克隆到psiCHECKTM-2載體（Promega）中的海腎熒光素酶開放閱讀框的下游，該載體還包含組成型表達(dá)的螢火蟲熒光素酶基因。通過Target Scan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）在線軟件預(yù)測得出，人的ABCA1 3'UTR具有兩個(gè)miR-146a結(jié)合位點(diǎn)：位點(diǎn)2在物種之間高度保守，位點(diǎn)1僅在人類和靈長類動(dòng)物中保守，見圖2。為了評(píng)估m(xù)iR-146a對(duì)人ABCA1 3'UTR的影響，本研究使用了報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒與miR-146a共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，并分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照模擬物——Con-miR（Con-miR組）及不同濃度（10 nmol/L和20 nmol/L）miR-146a（10 nmol/L miR-146a組和20 nmol/L miR-146a組）。之后使用Multisite-Quickchange（Stratagene公司）在ABCA1的3'UTR內(nèi)預(yù)測miR-146a位點(diǎn)的區(qū)域中進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建兩個(gè)位點(diǎn)的突變載體（SDM1和SDM2），并通過測序確認(rèn)所構(gòu)建載體序列的準(zhǔn)確性。將野生型（WT）3'UTR熒光素酶報(bào)告載體分別用Li-pofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Con-miR（WT+Con-miR組）和miR-146a（WT+miR-146a組），將1 μg的SDM1和/或SDM2 3'UTR熒光素酶報(bào)告載體分別用Li-pofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miR-146a（分為 SDM1+miR-146a組、SDM2+miR-146a組、SDM1/SDM2+miR-146a組）。使用Dual-Glo螢光素酶測定系統(tǒng)（Promega）測量螢光素酶活性，將海腎熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為相應(yīng)的螢火蟲熒光素酶活性。

圖2 miR-146a與ABCA1 3'UTR結(jié)合情況Figure 2 Predicted annealing of miR-146a to the ABCA1 3'UTR

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均獨(dú)立重復(fù)4次，符合正態(tài)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-146a對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出效率的影響 空白對(duì)照組膽固醇流出效率為（21.38±8.94）%，陽性對(duì)照組為（58.63±7.31）%，陰性對(duì)照組為（14.55±5.72）%，模擬物組為（17.08±4.13）%，抑制劑組為（56.03±5.88）%。五組膽固醇流出效率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.43，P=0.02）；陽性對(duì)照組膽固醇流出效率高于空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組和模擬物組膽固醇流出效率低于陽性對(duì)照組，抑制劑組膽固醇流出效率高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和模擬物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 miR-146a對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 各組正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模擬物組正常細(xì)胞水平低于NC組，抑制劑組正常細(xì)胞水平高于NC組和模擬物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模擬物組壞死細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞水平高于NC組，抑制劑組壞死細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞水平低于NC組和模擬物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖3。

表2 三組正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞水平比較（±s，%，n=4）Table 2 Comparison of levels of normal cells，necrotic cells and apoptotic cells among the three groups

表2 三組正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞水平比較（±s，%，n=4）Table 2 Comparison of levels of normal cells，necrotic cells and apoptotic cells among the three groups

注：與NC組比較，aP＜0.05；與模擬物組比較，bP＜0.05

組別 正常細(xì)胞 壞死細(xì)胞 晚期凋亡細(xì)胞 早期凋亡細(xì)胞NC 組 83.28±2.62 4.56±1.20 4.49±0.14 8.72±1.25模擬物組 78.37±8.22a 5.13±2.06a 8.69±2.15a 9.07±1.52a抑制劑組 98.63±7.28ab0.25±0.05ab 0.13±0.06ab 0.59±0.07ab F值 2.13 5.61 6.17 5.22 P值 0.04 0.01 0.01 0.01

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡情況Figure 3 Apoptosis of macrophage-derived foam cells by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry

2.3 抑制NF-κB通路對(duì)miR-146a及ABCA1表達(dá)的影響各組NF-κB通路p50、p65及 ABCA1的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；模擬物組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量高于NC組，ABCA1的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模擬物+PDTC組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量低于模擬物組，ABCA1的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量高于模擬物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。抑制劑組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量低于NC組，ABCA1的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；抑制劑+PDTC組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量高于抑制劑組，ABCA1的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量低于抑制劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組NF-κB通路p50、NF-κB通路p65、ABCA1的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n=4）Table 3 Comparison of the mRNA and protein relative expression levels of NF-κB pathway p50，NF-κB pathway p65 and ABCA1 in each group

表3 各組NF-κB通路p50、NF-κB通路p65、ABCA1的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n=4）Table 3 Comparison of the mRNA and protein relative expression levels of NF-κB pathway p50，NF-κB pathway p65 and ABCA1 in each group

注：與NC組比較，aP＜0.05；與模擬物組比較，bP＜0.05；與抑制劑組比較，cP＜0.05

mRNANF-κB通路p50蛋白NF-κB通路p65 mRNANF-κB通路p65蛋白ABCA1 mRNAABCA1蛋白NC 組 1.08±0.15 1.02±0.05 1.07±0.13 1.03±0.08 1.14±0.21 1.08±0.20模擬物組 3.02±0.28a 4.16±0.52a 2.78±0.25a 2.84±0.34a 0.28±0.04a 0.31±0.08a模擬物 +PDTC 組 1.43±0.21b 2.08±0.17b 1.11±0.13b 1.02±0.11b 0.95±0.24b 1.13±0.24b抑制劑組 0.41±0.08a 0.85±0.11a 0.61±0.09a 0.63±0.02a 1.68±0.21a 1.73±0.33a抑制劑 +PDTC 組 0.82±0.12c 1.53±0.25c 0.98±0.09c 1.03±0.13c 1.22±0.18c 1.27±0.23c F值 5.21 3.07 6.29 3.15 3.62 5.22 P值 0.02 0.02 0.01 0.03 0.03 0.01組別 NF-κB通路p50

2.4 miR-146a靶向結(jié)合ABCA1 3'UTR情況 Con-miR組ABCA1 3'UTR活性為（100.18±6.12），10 nmol/L miR-146a組 為（53.27±10.18），20 nmol/L miR-146a組為（60.18±8.37）；三組ABCA1 3'UTR活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.16，P=0.030）；10 nmol/L miR-146a組和20 nmol/L miR-146a組ABCA1 3'UTR活性低于Con-miR組，20 nmol/L miR-146a組ABCA1 3'UTR活性低于10 nmol/L miR-146a組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。WT+Con-miR組ABCA1 3'UTR活性為（100.03±5.28），WT+miR-146a組為（70.18±8.33），SDM1+miR-146a組 為（82.37±11.27），SDM2+miR-146a組為（117.35±6.58），SDM1/SMD2+miR-146a組為（124.10±9.57）；各組ABCA1 3'UTR活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.52，P=0.01）；WT+miR-146a組和SDM1+miR-146a組ABCA1 3'UTR活性低于WT+Con-miR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SDM2+miR-146a組和SDM1/SMD2+miR-146a組ABCA1 3'UTR活性與WT+Con-miR組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

細(xì)胞膽固醇水平的調(diào)控包括膽固醇攝取、內(nèi)源性合成和外排之間的平衡。既往研究表明，脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)紊亂可導(dǎo)致多種疾病，包括AS、代謝綜合征、2型糖尿病及阿爾茨海默病等［8］。巨噬細(xì)胞膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)失衡貫穿泡沫細(xì)胞形成的整個(gè)過程，而膽固醇流出是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積、防止泡沫細(xì)胞形成和AS發(fā)生具有重要意義。研究表明，抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積（泡沫化）和炎癥因子釋放是防治AS的重要途徑［4，9］。本研究通過ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供了基礎(chǔ)。

研究表明，高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）及其主要載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，ApoA1）在去除細(xì)胞中多余膽固醇及其向肝臟運(yùn)輸過程中起關(guān)鍵作用，這一過程稱為膽固醇逆向運(yùn)輸［10］。當(dāng)多余的膽固醇來自動(dòng)脈斑塊中的泡沫細(xì)胞時(shí)，膽固醇逆向運(yùn)輸被認(rèn)為是HDL抗AS的基礎(chǔ)［11］。ABCA1和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1（ABCG1）可促進(jìn)膽固醇從包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的外周細(xì)胞中流出，此外ABCA1還負(fù)責(zé)啟動(dòng)肝臟中的HDL形成，如Tangier?。ㄒ环N以血漿HDL較低為特征的疾?。┑陌l(fā)生與ABCA1基因突變密切相關(guān)［12］。miR-146a是一個(gè)典型的多功能miR，可在其下游基因的介導(dǎo)下參與免疫、炎癥、腫瘤等多種生理病理過程［13-15］。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈硬化病變?cè)絿?yán)重，miR-146a表達(dá)水平越高［7］。但泡沫細(xì)胞中miR-146a與ABCA1的關(guān)系尚不清楚。本研究結(jié)果表明，miR-146a可通過抑制ABCA1表達(dá)而抑制其介導(dǎo)的膽固醇流出。

本研究進(jìn)一步分析了miR-146a對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146a mimics促進(jìn)了巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的凋亡，提示miR-146a對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)展具有重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是miR-146a參與AS的最重要信號(hào)通路之一，其在LPS、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）誘導(dǎo)的miR-146a轉(zhuǎn)錄過程中起關(guān)鍵作用［16］。本研究結(jié)果顯示，模擬物+PDTC組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量低于模擬物組，ABCA1的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量高于模擬物組；抑制劑+PDTC組NF-κB通路p50、p65的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量低于抑制劑組，ABCA1的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量高于抑制劑組，提示miR-146a對(duì)NF-κB存在依賴性。

研究證實(shí)，ABCA1的3'UTR長于其他與AS相關(guān)的基因，是多個(gè)miR的靶標(biāo)［17］。如miR-122能靶向沉默ABCA1，在小鼠和非人類的靈長類動(dòng)物中的沉默降低了膽固醇的合成及肝臟脂肪酸、血漿膽固醇水平，并增加肝臟脂肪酸β-氧化［18-19］。與miR-122相反，miR-758在不同組織和細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)，其對(duì)ABCA1的作用影響了細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)［20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABCA1 3'UTR具有兩個(gè)miR-146a結(jié)合位點(diǎn)，其中1個(gè)位點(diǎn)消除了miR-146a對(duì)ABCA1 3' UTR活性的抑制作用。

綜上所述，miR-146a可通過抑制ABCA1表達(dá)而抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出，從而導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展，而NF-κB可以減輕miR-146a對(duì)ABCA1表達(dá)的抑制作用。后續(xù)應(yīng)研究miR-146a的有效調(diào)控方法，進(jìn)而為防止脂質(zhì)在血管壁蓄積及治療AS提供新的靶點(diǎn)。

作者貢獻(xiàn)：幸世峰和駱小梅進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；孫理華進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集、整理、分析，論文的修訂；幸世峰進(jìn)行結(jié)果分析與解釋，撰寫論文；駱小梅負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。