CD45RO+記憶T細胞作為非小細胞肺癌患者預后標志物的研究

譚琪凡 李浩洋 俞孟軍 唐曉楠 譚金晶 張樹才 王敬慧

在世界范圍內(nèi)，肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是導致惡性腫瘤死亡的主要原因。非小細胞肺癌（non‐small cell lung cancer, NSCLC）約占原發(fā)性肺癌的85%[1]，70%的患者在確診時已處于晚期，5年生存率低于15%[2]。傳統(tǒng)的化療、放療和靶向治療等綜合治療可顯著延長患者生存期。但化療的中位生存期僅8個月‐10個月，靶向治療不可避免的會出現(xiàn)耐藥[3]。隨著腫瘤學、免疫學、分子生物學等相關學科的迅速發(fā)展，免疫治療給腫瘤治療帶來了革命性的變化，被認為是最有希望治愈惡性腫瘤的治療手段。免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs），包括Pembrolizumab、Nivolumab、Atezolizumab和Durvolumab已被美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準用于治療肺癌[4‐7]。然而，只有約20%的NSCLC患者適合ICIs，臨床實踐中程序性死亡受體‐配體1（programmed cell death ligand 1, PD‐L1）表達和腫瘤突變負擔的預測作用不足[8]。為了改善NSCLC患者的預后，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的免疫生物標志物。

通過揭示腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）在控制腫瘤行為中的關鍵作用[9,10]，腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs）作為TME的重要組成部分的預后意義及其可能的預測價值已成為癌癥研究的熱點。研究表明，TILs在頭頸部[11]、肺部[12]、腎臟[13]等多種癌癥的預后中具有重要意義。一些研究報道了TILs的存在與預后之間的正相關關系[14]，而其他研究報道了沒有關系[15]或負相關關系[16]。

人類CD45是一種跨膜酪氨酸磷酸酶，存在于除紅細胞外的所有造血細胞上。它們以不同的亞型存在，這些亞型在指定為CD45R的一組限制性細胞類型上表達[17]。大多數(shù)初始T細胞表達一種稱為CD45RA的CD45R，而記憶T細胞表達另一種亞型，稱為CD45RO[18]。CD45RO+T淋巴細胞與初始T細胞（CD45RA+）相比，遇到抗原反應更快，抗原刺激強度更大[19]?，F(xiàn)已有多項研究報道了，CD45RO+TILs的高表達與癌癥較好的預后顯著相關，包括食管癌[20,21]、結直腸癌[22,23]、乳腺癌[24]、子宮內(nèi)膜癌[25]、胃癌[26]和肝細胞癌[27]等。在一項結直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CD45RO+TILs也可被用作潛在的NSCLC的候選免疫標志物[28]。因此，我們擬研究CD45RO+TILs細胞對NSCLC患者預后的影響。本研究評估了CD45RO+TILs密度對I期‐III期NSCLC患者生存預后的影響及其與患者臨床特征的關系。PD‐L1與患者的預后[29]息息相關，PD‐L1過表達與亞洲NSCLC患者總生存期（overall survival, OS）時間更短有關。本研究還聯(lián)合CD45RO+TILs密度和患者腫瘤細胞PD‐L1表達水平，探索雙標志物聯(lián)用對NSCLC患者的預后價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 回顧性地納入2013年1月‐2016年12月在首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院接受治療的患者，納入標準：①新診斷的原發(fā)性NSCLC患者；②術前未接受治療；③充分的隨訪信息。排除標準：①我們沒有足夠組織進行檢測的患者；②有其他惡性腫瘤的患者。腫瘤根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer,AJCC）指南（第8版）進行分期。根據(jù)世界衛(wèi)生組織指南進行亞型分類[30]。患者手術切除的石蠟包埋組織制備成組織微陣列（tissue microarray, TMA）。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會批準。

167例NSCLC患者中位年齡61歲（35歲‐84歲），其中96例患者（57.5%）>60歲，男性119例（71.3%），女性48例（28.7%）。167例患者中，吸煙患者103例（61.7%）。其分期為I期48例（28.8%），II期42例（25.1%），III期77例（46.1%）。其他腫瘤特征為淋巴結轉移陽性81例（48.5%）、淋巴結轉移陰性86例（51.5%）；肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）77例（46.1%）和肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）90例（53.9%）。

1.2 多重熒光免疫組化染色 使用Opal 7色多重熒光染色試劑（PerkinElmer, USA）在4 μm厚的TMA切片上進行染色。免疫組化（immunohistochemistry, IHC）法對TMA切片進行脫蠟和水化后，用檸檬酸鹽進行組織抗原修復。此后每一步標記染色步驟根據(jù)試劑盒說明書進行，簡述為：用阻斷緩沖液阻斷25 min后，首先在室溫下與一抗孵育2 h，然后在室溫下與二抗（Opal Polymer HRP Ms+Rb, USA）孵育30 min，然后洗滌；為了產(chǎn)生熒光信號，TMA切片在室溫下與Opal工作液孵育10 min。在下一個標記染色之前，切片用微波爐加熱，去除非共價結合的抗體，之后重復上述步驟。最后用DAPI染色細胞核，封片[31]。使用的一抗為：細胞角蛋白CK單克隆抗體（pan‐CK cocktail, Abcam）、CD45RO蛋白單克隆抗體（UCHL1克隆，ThermoFisher）、PD‐L1單克隆抗體（E1L3N克隆，CST）。

1.3 多重熒光染色結果 使用Vectra2.1多光譜顯微鏡成像系統(tǒng)（PerkinElmer，美國）采集多重熒光染色組織切片圖像。使用Inform 2.2軟件（PerkinElmer，美國）對組織切片圖像進行光譜拆分；組織類型拆分；細胞識別；細胞分型；計數(shù)評分，從而對圖像進行分析。使用DAPI細胞核染色進行細胞識別。樣本中每個標記物的表達都是通過密度來分析的，密度根據(jù)陽性細胞的百分比來計算。

1.4 統(tǒng)計分析 采用非參檢驗分析CD45RO+TILs與患者臨床特征的關系，使用Kaplan-Meier方法和Cox風險比例模型分析其與預后和臨床病理特征的關系。統(tǒng)計分析和作圖使用SPSS（IBM，美國）和R（3.6.5）進行。

2 結果

2.1 NSCLC組織芯片多重熒光免疫組化染色 我們在167例NSCLC腫瘤組織中檢測了CK、CD45RO以及PD‐L1蛋白的表達情況（圖1）。患者人口學特征見表1。CK標記為綠色，特異表達在腫瘤細胞質(zhì)。CD45RO標記為紅色，表達在T淋巴細胞膜表面。PD‐L1標記為黃色，表達在細胞膜表面。利用人工智能圖像識別技術，結合細胞形態(tài)和CK蛋白的染色情況，我們將組織劃分為腫瘤區(qū)和基質(zhì)區(qū)。腫瘤區(qū)主要由癌巢的腫瘤細胞以及浸潤的淋巴細胞構成?；|(zhì)區(qū)內(nèi)的主要組成為成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞等。

圖1 多標記免疫熒光染色后CD45RO和PD-L1在非小細胞肺癌中的表達。A：CD45RO、PD-L1、CK表達及DAPI染色的共定位圖片（×200）；B：CK表達（細胞質(zhì)，綠色）（×200）；C：PD-L1表達（細胞膜，黃色）（×200）；D：CD45RO+表達（細胞膜，紅色）（×200）；E：CD45RO-表達（T淋巴細胞膜，紅色）（×200）；F：腫瘤區(qū)和基質(zhì)區(qū)依照組織細胞形態(tài)和CK表達情況進行劃分：腫瘤區(qū)（綠色），基質(zhì)區(qū)（紅色）（×200）Fig 1 CD45RO and PD-L1 expression in non-small cell lung cancer by multiplex immunofluorescence staining. A: a merged picture of expression of CD45RO, PD-L1, CK and DAPI (×200); B: CK expression (cytoplasmic, Green) (×200); C: PD-L1 expression (Cell membrane, Yellow) (×200); D:CD45RO+ expression (Cell membrane, Red) (×200); E: CD45RO- expression (Cell membrane, Red) (×200); F: tumor compartments and stromal compartments divided by CK, Tumor (Green), stromal (Red) (×200)

2.2 CD45RO+TILs的密度與臨床病理特征的關系CD45RO+TILs在腫瘤區(qū)和基質(zhì)區(qū)均有富集，基質(zhì)區(qū)的密度較腫瘤區(qū)更高。我們分別針對腫瘤區(qū)和基質(zhì)區(qū)的CD45RO+TILs，分析其密度與患者性別、年齡、吸煙情況、臨床分期等臨床特征之間的關系。在NSCLC腫瘤區(qū)，>60歲患者CD45RO+TILs密度高于≤60歲患者（P=0.027），吸煙患者CD45RO+TIL密度高于非吸煙患者（P=0.006），II期患者CD45RO+TIL密度高于I期和III期患者（P=0.014）?；|(zhì)區(qū)CD45RO+TILs的密度在各臨床特征分層之間的差異無統(tǒng)計學意義。進一步對肺癌病理亞型分析發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌患者CD45RO+TILs密度高于肺腺癌患者（圖2），無論是在腫瘤區(qū)（P=0.039）還是在基質(zhì)區(qū)（P=0.002）。吸煙與非吸煙患者腫瘤區(qū)CD45RO+TILs密度的差異主要體現(xiàn)在肺腺癌患者中（P=0.005）。而II期患者腫瘤區(qū)CD45RO+TILs相較于I期和III期的高度富集則體現(xiàn)在肺鱗癌患者中（P=0.027）（圖3）。

圖2 非小細胞肺癌中CD45RO+ TILs與臨床病理特征的關系。A：根據(jù)年齡；B：根據(jù)吸煙；C：根據(jù)臨床分期；D：根據(jù)病理類型。Fig 2 Significance of CD45RO+ TILs with clinicopathologic characteristics in non-small cell lung cancer. A: according to age; B: according to smoking; C: according to clinical stage; D: according to pathological type. TILs: tumor infiltrating lymphocytes; ADC: lung adenocarcinoma；SCC:lung squamous cell carcinoma

圖3 肺腺癌及肺鱗癌中CD45RO+ TILs與臨床病理特征的關系。A：肺腺癌中CD45RO+ TILs密度與吸煙的關系；B：肺鱗癌CD45RO+ TILs密度與臨床分期的關系Fig 3 Relationship between CD45RO+ TILs and clinicopathological features in lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma. A:relationship between CD45RO+ TILs density and smoking in lung adenocarcinoma; B: relationship between CD45RO+ TILs density and clinical stage in lung squamous cell carcinoma.

2.3 CD45RO+TILs的密度與患者的生存關系 所有患者的最后一次隨訪日期為2019年6月30日。當時，已有105例患者死亡，62例患者存活。隨訪記錄了患者疾病復發(fā)和死亡的日期，計算出患者無病生存期（disease‐free survival, DFS）和OS。生存分析發(fā)現(xiàn)在NSCLC腫瘤組織基質(zhì)區(qū)CD45RO+TILs的密度與患者OS顯著相關（P=0.007），浸潤程度高的患者預后生存時間較長（圖4）。多因素Cox回歸分析顯示，基質(zhì)區(qū)CD45RO+TILs的密度是NSCLC的獨立預后因素（HR=0.559, 95%CI:0.377‐0.829, P=0.004）（表2）。由于CD45RO+TILs在肺鱗癌和肺腺癌之間表達差異較大，我們對肺鱗癌和肺腺癌分別進行了生存分析。在肺腺癌患者中，基質(zhì)區(qū)CD45RO+TILs密度與患者的DFS和OS都密切相關，CD45RO+TILs密度高的患者都有更長的生存時間（DFS:P=0.034; OS:P<0.001）。多因素Cox回歸分析顯示，基質(zhì)區(qū)CD45RO+TILs的密度是肺腺癌OS的獨立預后因素（HR=0.352, 95%CI: 0.193‐0.641,P=0.001）（表3）。在肺鱗癌患者中，盡管有相同的趨勢，但結果沒有獲得統(tǒng)計學意義。而腫瘤區(qū)的CD45RO+TILs的密度無論是在鱗癌還是腺癌中，都與患者的DFS和OS均沒有顯著相關性。

圖4 CD45RO+ TILs與無病生存期以及總生存期的Kaplan-Meier曲線分析。A：非小細胞肺癌基質(zhì)區(qū)CD45RO+ TILs密度與患者總生存期顯著相關；B：肺腺癌基質(zhì)區(qū)CD45RO+ TILs密度與患者無病生存期密切相關；C：肺腺癌基質(zhì)區(qū)CD45RO+ TILs密度與患者總生存期密切相關。Fig 4 Kaplan-Meier curves for Correlations of CD45RO+ TILs with disease-free survival and overall survival. A: the density of CD45RO+ TILs in the stromal compartment of non-small cell lung cancer was significantly associated with patient overall survival; B: the density of CD45RO+ TILs in the stromal compartment of lung adenocarcinoma was strongly associated with patient disease-free survival; C: the density of CD45RO+ TILs in the stromal region of lung adenocarcinoma was strongly associated with patients' OS; OS: overall survival; DFS: disease-free survival.

表2 多因素分析CD45RO+ TILs在非小細胞肺癌中的總生存期Tab 2 Multivariate analysis of CD45RO+ TILs in non-small cell lung cancer overall survival

表3 多因素分析CD45RO+ TILs在肺腺癌中的總生存期Tab 3 Multivariate analysis of overall survival of CD45RO+ TILs in lung adenocarcinoma

2.4 CD45RO+TILs聯(lián)合PD‐L1表達與患者的生存關系 目前的研究報道顯示，腫瘤細胞高表達PD‐L1能抑制效應T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，是影響患者預后的一個重要因素。因此我們將腫瘤組織中所有區(qū)域CD45RO+TILs的密度聯(lián)合腫瘤細胞表達PD‐L1的評分將患者分為四組：PD‐L1+/CD45RO+，標志物雙陽性組；PD‐L1‐/CD45RO‐，標志物雙陰性組；PD‐L1+/CD45RO‐和PD‐L1‐/CD45RO+，標志物單陽性組。

這四組NSCLC患者的DFS（P=0.021）和OS（P=0.031）生存曲線呈現(xiàn)明顯階梯差異，其中標志物雙陽性患者DFS及OS時間最長，PD‐L1+/CD45RO‐的患者最短（圖5A、圖5B）。多因素Cox回歸分析結果顯示，PD‐L1+/CD45RO‐是DFS（HR=2.221, 95%CI: 1.258‐3.919,P=0.006）（表4）及OS（HR=1.781, 95%CI: 1.114‐2.845,P=0.016）（表5）預后的獨立因素，相較于其他三組患者預后差的風險更高。在肺腺癌中，PD‐L1‐/CD45RO+組較其他三組有更好的OS（P=0.004，圖5C），多因素Cox回歸分析結果顯示，PD‐L1‐/CD45RO+是OS（HR=0.446,95%CI: 0.225‐0.885,P=0.021）預后的獨立因素（表6）。

表4 多因素分析CD45RO+ TILs和PD-L1雙標記在非小細胞肺癌中的無病生存期Tab 4 Multivariate analysis of CD45RO+ TILs and PD-L1 double markers for disease-free survival in non-small cell lung cancer

圖5 CD45RO+ TILs聯(lián)合PD-L1的表達與無病生存期以及總生存期的Kaplan-Meier分析。A：PD-L1+/CD45RO+組非小細胞肺癌患者無病生存期最長，PD-L1+/CD45RO-組最短；B：PD-L1+/CD45RO+組非小細胞肺癌患者總生存期最長，PD-L1+/CD45RO-組最短；C：在肺腺癌中，PD-L1-/CD45RO+組較其他三組有更好的總生存期Fig 5 Kaplan-Meier curves for correlations of CD45RO+ TILs and PD-L1 expression with disease-free survival and overall survival. A: patients with non-small cell lung cancer in the PD-L1+/CD45RO+ group had the longest disease-free survival and those in the PD-L1+/CD45RO- group had the shortest; B: non-small cell lung cancer patients in the PD-L1+/CD45RO+ group had the longest overall survival and those in the PD-L1+/CD45RO-group had the shortest overall survival; C: in lung adenocarcinoma, the PD-L1-/CD45RO+ group had better overall survival than the other three groups

表5 多因素分析CD45RO+ TILs和PD-L1雙標記在非小細胞肺癌中的總生存期Tab 5 Multivariate analysis of CD45RO+ TILs and PD-L1 double markers for overall survival in non-small cell lung cancer

3 討論

癌癥免疫療法的成功，已經(jīng)證明免疫細胞，特別是T細胞，可以被用來消除腫瘤細胞。盡管有持續(xù)的臨床療效，但仍然只有一小部分癌癥患者受益[32]。作為TME的主要組成部分，免疫浸潤細胞已被證明對腫瘤進展以及免疫治療反應至關重要[33]。因此，更好地了解TME中的先天性免疫細胞和適應性免疫細胞對于破譯免疫治療機制、定義預測性生物標志物和識別新的治療靶點至關重要。

在腫瘤相關的免疫過程中，CD45RA+初始T細胞經(jīng)過抗原呈遞激活，分化成效應T細胞和記憶T細胞。效應T細胞包括CD4+輔助T細胞和CD8+殺傷T細胞，直接參與腫瘤殺傷過程。記憶T細胞在組織中起監(jiān)視作用，能夠長期存活，并且在二次免疫反應中起非常重要的作用。CD45RO為記憶T細胞的表面抗原，是區(qū)分初始T細胞和記憶T細胞的重要標志。

CD45RO+T記憶細胞在NSCLC組織中的浸潤情況，已有一些報道。早期研究中，研究者使用免疫組化的方法評估CD45RO+TILs密度與患者臨床特征和預后的關系。Paulsen等[12]的研究結果認為，無論是NSCLC還是肺腺癌及肺鱗癌亞組中，CD45RO+TILs密度與臨床病理特征的差異均無統(tǒng)計學意義。本研究中，我們劃分了癌巢所在的腫瘤區(qū)和周圍的基質(zhì)區(qū)，分別分析不同浸潤位置的CD45RO+TILs密度與患者臨床病理特征的關系。我們發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中，基質(zhì)區(qū)CD45RO+TILs密度較腫瘤區(qū)更高，腫瘤區(qū)CD45RO+TILs密度與年齡、吸煙以及TNM分期方面差異均有統(tǒng)計學意義。而基質(zhì)區(qū)CD45RO+TILs密度與各臨床特征之間的差異均無統(tǒng)計學意義。

同理，關于CD45RO+TILs密度與NSCLC預后的關系，既往一些研究中存在的爭議[12,34‐36]可能也是由于評價體系中沒有明確CD45RO+T細胞的浸潤位置造成的。尹婕等[34]的研究中發(fā)現(xiàn)，CD45RO+TILs在NSCLC腫瘤組織和正常組織中的表達無統(tǒng)計學意義。我們的研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)區(qū)CD45RO+TILs密度與NSCLC患者的生存預后顯著相關，而腫瘤區(qū)未見顯著差異。針對CD45RO+TILs密度與肺腺癌和肺鱗癌關系現(xiàn)已有相關報道，俞達輝等[36]的研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌腫瘤組織中CD45RO表達水平越高，患者的DFS及OS越長。這與我們的研究結果基質(zhì)區(qū)CD45RO+TILs的密度是肺腺癌的獨立預后因素一致。Paulsen等[12]在他們的研究對列里發(fā)現(xiàn)CD45RO+TILs的密度在肺鱗癌而非肺腺癌中具有預后意義。這與我們的結論相反，我們的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤區(qū)及基質(zhì)區(qū)CD45RO+TILs的密度在肺鱗癌中均不具有統(tǒng)計學意義。這可能與研究的人群差異有關，Paulsen的人群均為歐洲人種，而我們的研究均為亞洲人種。除了人種之外，我們在研究中發(fā)現(xiàn)CD45RO+TILs的密度與患者的吸煙情況以及腫瘤的臨床分期相關，這也可能是導致研究結果不同的原因。需要擴大樣本量來獲得更有統(tǒng)計學說服力的數(shù)據(jù)。

本研究還聯(lián)合CD45RO+TILs密度和患者腫瘤細胞PD‐L1表達水平對NSCLC患者進行生存預后分析。NSCLC生存分析顯示，雙標志物評分PD‐L1+/CD45RO‐患者組相比于其他三組有最短的OS及DFS。這一結果也比較符合當下的假說，即腫瘤高表達PD‐L1促進腫瘤逃逸，而高免疫細胞浸潤顯示機體對腫瘤殺傷的“高敏感”狀態(tài)。CD45RO+TILs和PD‐L1都是參與腫瘤免疫過程的重要分子。因此研究這兩個標志物對未經(jīng)免疫治療患者的預后影響，可能更具有臨床價值。

本研究存在一些局限性。首先，這是一項回顧性研究，樣本量相對較小，隨訪資料的收集可能存在一些偏倚。其次，組織微陣列芯片中的芯條只是腫瘤的一小部分，我們可能需要在大組織中進行更深入的研究，挖掘更有價值的信息。

綜上所述，我們的研究揭示了基質(zhì)區(qū)CD45RO+TILs在NSCLC及其亞組肺腺癌中是一種強有力的預后因子，是較好的OS的獨立預后因素。當CD45RO+TILs與腫瘤細胞表達的PD‐L1聯(lián)合使用時，NSCLC中PD‐L1+/CD45RO‐患者組相比于其他三組有最短的OS及DFS，可作為較差的預后預測因子。

Author contributions

Tan QF, Tan JJ and Wang JH conceived and designed the study. Tan QF, Li HY and Tang XN performed the experiments.Tan QF and Tan JJ analyzed the data. Tan JJ and Yu MJ contributed analysis tools. Zhang SC, Tan JJ and Wang JH provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.