NF-κB信號(hào)通路抑制劑與溶瘤麻疹病毒疫苗株協(xié)同抗肺癌的作用及機(jī)制

夏茂 孟剛 董杰

肺癌在我國各類疾病死因中居首位，而非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer, NSCLC）是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。雖然常規(guī)治療手段如手術(shù)、放化療、靶向治療等不斷發(fā)展，但對(duì)一些耐藥性或難治性終末期肺癌仍然束手無策，迫切需要安全有效可行的治療手段，如基因/生物治療、免疫治療等[2]。

具有自我復(fù)制功能和良好的腫瘤選擇性殺傷作用，同時(shí)有良好安全性的病毒被稱為溶瘤病毒[3]。近10年來在臨床試驗(yàn)均有廣泛深入的研究，目前至少有6種溶瘤病毒進(jìn)入了I期/II期臨床試驗(yàn)，包括腺病毒（Adenovirus）治療頭頸部腫瘤[4,5]；新城疫病毒（Newcastle disease virus）治療復(fù)發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤[6,7]；麻疹病毒疫苗株（Measles virus vaccine strain）治療骨髓瘤[8]；此外還有單皰疹病毒（Herpers simplex virus）、呼腸孤病毒（Reovirus）及牛痘病毒（Vaccinia）的臨床試驗(yàn)等，均顯示出在人體治療過程中良好的安全性及有效性[9]。

麻疹病毒減毒疫苗株（MV‐Edmonston, MV‐Edm）用于健康未感染人群接種逾60年，未出現(xiàn)致病、致死的報(bào)道，擁有可靠的安全記錄[10]。研究[11,12]發(fā)現(xiàn)，麻疹病毒疫苗具有腫瘤選擇性殺傷作用，對(duì)正常細(xì)胞無損傷或微損傷。能否有效提高M(jìn)V‐Edm溶瘤效果，取決于明確其溶瘤機(jī)制。我們在既往研究中發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，MV‐Edm可誘導(dǎo)NSCLC產(chǎn)生細(xì)胞自噬來抑制干擾素或調(diào)控細(xì)胞色素C的釋放來抑制細(xì)胞的凋亡，從而介導(dǎo)非Caspase依賴的細(xì)胞死亡[13]。自噬在病毒的感染和復(fù)制中扮演著雙刃劍的角色，一方面可以通過直接降解病毒的成分蛋白、激活固有免疫或適應(yīng)性免疫等機(jī)制抵抗某些病毒；另一方面，一些病毒能夠誘導(dǎo)自噬來抵抗細(xì)胞死亡[14‐16]。既往研究[17,18]表明細(xì)胞自噬可以調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B, NF‐κB）通路，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。提示我們MV‐Edm誘導(dǎo)細(xì)胞自噬是否亦可以調(diào)控NF‐κB通路，從而對(duì)病毒的溶瘤作用產(chǎn)生影響。

本研究應(yīng)用Western blot方法檢測溶瘤麻疹病毒疫苗株單獨(dú)感染人肺癌細(xì)胞A549和H1299或者使用細(xì)胞自噬相關(guān)的短干擾RNA（short interfering RNA,siRNA）/NF‐κB通路抑制劑PS1145后NF‐кB通路的p‐IκBα及IκBα以及凋亡相關(guān)蛋白PARP及BAX的表達(dá)水平，同時(shí)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞凋亡率以及采用噻唑藍(lán)［3‐(4,5)‐dimethylthiahiazo(‐z‐y1)‐3,5‐di‐phenytetrazoliumromide, MTT］法檢測各組細(xì)胞的存活率的變化。從體外實(shí)驗(yàn)證明溶瘤麻疹病毒疫苗株誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可以調(diào)控NF‐κB信號(hào)通路的激活，而抑制NF‐κB通路的激活可增加MV‐Edm感染誘導(dǎo)的人肺癌細(xì)胞A549和H1299的凋亡率，增強(qiáng)其溶瘤作用，提供了NF‐κB信號(hào)通路抑制劑PS1145聯(lián)合MV‐Edm協(xié)同抗肺癌的新策略。并揭示了溶瘤麻疹病毒疫苗株通過細(xì)胞自噬調(diào)控NF‐κB信號(hào)通路拮抗肺癌細(xì)胞凋亡的溶瘤新機(jī)制，為溶瘤麻疹病毒疫苗株的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用的進(jìn)一步優(yōu)化提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 靶向ATG7（Invitrogen, HSS116182），BECN1（Invitrogen, HSS112741）及negative control（Invitrogen,12935400）的siRNA均購自Thermo Fisher Scientific公司。PVDF膜（Roche, 03010040001），WB Immobilon ECL發(fā)光液（Millipore, WBKLS0500）。PS1145（CFAD‐P6624‐5MG）購自Sigma‐Aldrich?？贵w：抗GAPDH（bioworld，MB001，1:5,000稀釋），抗ATG7（Cell Signaling Technology，#2631，1:1,000稀釋），抗BECN1（Cell Signaling Technology，#3738，1:1,000稀釋），抗IκBα（Cell Signaling Technology，#4814，1:1,000稀釋），抗p‐IκBα（Santa Cruz，sc‐52943，1:500稀釋）和抗SQSTM1/p62（Abcam，ab109012，1:5,000稀釋）。

1.2 溶瘤麻疹病毒疫苗株的擴(kuò)增 將Vero細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，至融合度為50%‐60%時(shí)吸去上清。PBS充分洗去細(xì)胞表層血清，然后去掉PBS。加入Opti‐MEM和MV‐Edm，并放入37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)至合胞體形成率約為70%時(shí)移入32 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)合胞體形成率接近100%時(shí)，收集培養(yǎng)皿中的所有細(xì)胞于EP管中，反復(fù)凍融3次后離心，將上清（即MV‐Edm）放入‐80 °C冰箱分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人NSCLC株A549（CCL‐185）和H1299（CRL‐5803）及非洲綠猴腎細(xì)胞株Vero（CCL ‐ 81）均購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，以上細(xì)胞株均通過STR分型與ATCC細(xì)胞庫標(biāo)準(zhǔn)分型對(duì)比確認(rèn)。上述細(xì)胞使用含有5%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U/L青霉素和1 mg/mL鏈霉素（均購自Invitrogen）的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 °C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.4 Western blot 配制不同濃度的SDS‐PAGE分離膠（8%‐12%）和濃縮膠（5%），每個(gè)樣品的加樣量為30 μg，穩(wěn)壓（濃縮膠80 V 30 min，分離膠120 V約80 min）電泳。轉(zhuǎn)膜：將膜和濾紙按負(fù)極‐海綿‐3層濾紙‐凝膠‐PVDF膜‐3層濾紙‐海綿‐正極的順序放置，恒流（110 mA）轉(zhuǎn)膜60 min‐80 min不等，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。封閉：將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉1 h。孵育一抗：4 °C冰箱孵育一抗12 h‐16 h。孵育二抗：吸去一抗，洗膜5 min×3次，用相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再次洗膜5 min×3次。曝光：使用化學(xué)發(fā)光液在免疫印跡曝光系統(tǒng)上進(jìn)行曝光獲取圖像，用Image J軟件對(duì)條帶的密度進(jìn)行分析，計(jì)算各條帶的平均密度值。

1.5 MTT法 將A549/H1299細(xì)胞用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，接種于96孔板，置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔中加入不同處理，各濃度設(shè)5孔，并設(shè)調(diào)零孔（只有培養(yǎng)液）和對(duì)照孔（培養(yǎng)基+藥物溶解劑+細(xì)胞）。分別培養(yǎng)不同時(shí)間：每孔加入滅菌的5 mg/mL MTT（美國Sigma公司）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO液（美國Sigma公司）150 μL/孔，水平振蕩10 min使紫藍(lán)色結(jié)晶物充分溶解后置于高通量多功能微板測試（492 nm）測定各孔光吸收值（以A表示），以空白孔調(diào)零，取4孔平均值，計(jì)算出細(xì)胞抑制率IR=（1‐A/A0）×100%［A：各處理濃度組光吸收值；A0：未加處理組（對(duì)照組）光吸收值］。

1.6 細(xì)胞凋亡率檢測 采用Annexin V/PI雙染法，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測（購自美國BD公司）細(xì)胞凋亡率的變化。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，接種于12孔板，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。再使用0.25%胰酶（不含EDTA）消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使每個(gè)樣品約（0.5‐1）×106個(gè)/mL細(xì)胞，加入結(jié)合緩沖液500 μL，重懸細(xì)胞；室溫、避光條件下加入PI染液5 μL，室溫避光孵育5 min‐15 min，再加入Binding buffer 450 μL，混勻，使抗體與細(xì)胞充分結(jié)合，加入1 μL Annexin V‐PE染液，孵育15 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.7 siRNA轉(zhuǎn)染 以6孔板為例，將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度種板，用不含抗生素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至融合度為50%‐60%，去除培養(yǎng)基，Opti‐MEM洗2次；取100 nmol/L siRNA加入250 μL Opti‐MEM混合稀釋，同時(shí)取3 μL Lipofectamine 2000加入另一支已裝有250 μL Opti‐MEM的無RNase EP管中，輕柔混勻并室溫靜置5 min。將Lipofectamine 2000混合液加入含siRNA的EP管中，混勻并室溫靜置15 min。去除6孔板內(nèi)的Opti‐MEM，并將Lipofectamine 2000‐siRNA混合液加入相應(yīng)的需要轉(zhuǎn)染的孔中。細(xì)胞繼續(xù)放回37 °C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)均為3 次以上重復(fù)的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 溶瘤麻疹病毒疫苗株通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬調(diào)控NF‐κB信號(hào)通路 我們既往研究證實(shí)MV‐Edm可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制細(xì)胞凋亡。MV‐Edm誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬抑制細(xì)胞凋亡是否與NF‐κB信號(hào)通路相關(guān)呢？為了進(jìn)一步探究其中的機(jī)制，我們將自噬相關(guān)基因ATG7及BECN1的兩種siRNA以及無特異性沉默功能的陰性對(duì)照Control siRNA轉(zhuǎn)染A549和H1299細(xì)胞后感染MV‐Edm檢測SQSTM1蛋白，自噬通路的重要蛋白SQSTM1，作為一種自噬伴侶受體可以與細(xì)胞內(nèi)泛素化的蛋白結(jié)合，同時(shí)又與自噬體膜蛋白LC3相互作用從而選擇性自噬降解細(xì)胞內(nèi)底物。結(jié)果提示ATG7及BECN1的兩種siRNA確實(shí)可以抑制細(xì)胞自噬。與陰性對(duì)照組相比，MV‐Edm感染A549和H1299細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，而抑制了自噬相關(guān)基因后IκBα的蛋白水平明顯升高，不感染MV‐Edm時(shí)IκBα的蛋白水平無顯著變化（圖1），表明MV‐Edm誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對(duì)A549和H1299細(xì)胞感染MV‐Edm后NF‐κB信號(hào)通路的調(diào)控有至關(guān)重要的作用。

圖1 溶瘤麻疹病毒疫苗株通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬調(diào)控NF-κB信號(hào)通路從而抑制細(xì)胞凋亡。A：分別轉(zhuǎn)染Control、ATG7、BECN1三種siRNA到A549或者H1299細(xì)胞24 h，再用MOI為0.5的MV-Edm感染細(xì)胞48 h，去上清，收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot檢測IκBα以及SQSTM1的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，以Control siRNA組作為對(duì)照；B：分別轉(zhuǎn)染Control、ATG7、BECN1三種siRNA到A549或者H1299細(xì)胞，72 h后去上清，收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot檢測IκBα以及SQSTM1的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，以Control siRNA組作為對(duì)照。Fig 1 MV-Edm inhibits cell apoptosis by inducing autophagy to regulate NF-κB signaling pathway. A: A549 and H1299 cells transfected with siRNA targeting ATG7, or BECN1 or with nontargeting control siRNA for 24 h were infected with MV-Edm (MOI 0.5) for 48 h, IκBα, SQSTM1 and GAPDH was monitored by immunoblotting; B:A549 and H1299 cells transfected with siRNA targeting ATG7, or BECN1 or with nontargeting control siRNA for 72 h, IκBα,SQSTM1 and GAPDH was monitored by immunoblotting. NF-κB: nuclear factor kappa B; MOI: multiplicity of infection

2.2 MV‐Edm感染NSCLC誘導(dǎo)NF‐κB信號(hào)通路的激活，應(yīng)用IκB激酶（IκB kinase, IKK）抑制劑PS1145可以抑制NF‐κB信號(hào)通路的激活 靜息狀態(tài)下，NF‐κB二聚體與其抑制蛋白IκB結(jié)合以無活性狀態(tài)貯存于細(xì)胞質(zhì)中。IKK（即 Ikk復(fù)合體）觸發(fā)誘導(dǎo)刺激， NF‐κB與IκB解離，IκB蛋白即發(fā)生磷酸化既成為p‐IκB。釋放NF‐κB二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，作用于相應(yīng)基因的啟動(dòng)子，作為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和免疫的主要核轉(zhuǎn)錄因子。我們將MV‐Edm感染A549和H1299細(xì)胞，分別在不同時(shí)間點(diǎn)后收集細(xì)胞用Western blot方法檢測胞內(nèi)p‐IκBα和IκBα的表達(dá)情況既觀察NF‐κB通路的激活情況。結(jié)果如圖2所示，胞內(nèi)p‐IκBα蛋白量隨著MV‐Edm感染時(shí)間的延長逐漸升高，胞內(nèi)IκBα蛋白量隨著MV‐Edm感染時(shí)間的延長逐漸降低，提示MV‐Edm感染A549和H1299細(xì)胞后，激活細(xì)胞內(nèi)的NF‐κB信號(hào)通路。而當(dāng)我們用IKK抑制劑PS1145抑制NF‐κB信號(hào)通路后，p‐IκBα蛋白量較PS1145未處理組明顯降低，而IκBα則明顯升高，提示PS1145確實(shí)可以顯著抑制NF‐κB信號(hào)通路的激活。上述結(jié)果說明MV‐Edm感染NSCLC誘導(dǎo)NF‐κB信號(hào)通路的激活，應(yīng)用IKK抑制劑PS1145可以抑制NF‐κB信號(hào)通路的激活。

圖2 MV-Edm感染肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的激活，應(yīng)用IKK抑制劑PS1145可以抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。A：用MOI為0.5的MV-Edm分別處理A549和H1299細(xì)胞，在24 h、48 h和72 h收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot檢測p-IκBα和IκBα的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，以不感染病毒作為對(duì)照。Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度比。圖中Western blot結(jié)果選取自兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果之一；B：用NF-κB通路抑制劑PS1145（10 μm/L）分別預(yù)處理A549和H1299細(xì)胞，3 h后感染MOI為0.5的MV-Edm，48 h后收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot檢測p-IκBα和IκBα的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，以不感染病毒或/和不做PS1145預(yù)處理作為對(duì)照。Fig 2 MV-Edm infection of lung cancer cells induces activation of NF-κB signaling pathway,and application of IKK inhibitor PS1145 can inhibit the activation of NF-κB signaling pathway.A: The level of p-IκBα and IκBα was monitored by immunoblotting of A549 and H1299 cells after infection by MV-Edm (MOI 0.5) at 24 h, 48 h,and 72 h; B: The level of p-IκBα and IκBα was monitored by Western blot 48 h after infection of MV-Edm infection with or without IKK inhibitor PS1145.

2.3 抑制NF‐κB信號(hào)通路能促進(jìn)MV‐Edm感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 上述研究發(fā)現(xiàn)，MV‐Edm可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬調(diào)控NF‐κB信號(hào)通路從而抑制細(xì)胞凋亡，那么通過抑制NF‐κB信號(hào)通路是否可以誘導(dǎo)凋亡促進(jìn)溶瘤呢？我們通過IKK抑制劑PS1145抑制NF‐κB信號(hào)通路，進(jìn)一步檢測細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果如圖3所示，PS1145抑制NF‐κB信號(hào)通路后感染MV‐Edm，A549和H1299細(xì)胞的細(xì)胞凋亡顯著增多（P<0.01）。上述結(jié)果說明抑制NF‐κB信號(hào)通路能促進(jìn)MV‐Edm感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖3 抑制NF-κB信號(hào)通路可促進(jìn)MV-Edm感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（P<0.01）。A：用NF-κB通路抑制劑PS1145處理A549細(xì)胞，3 h后感染MOI為0.5的MV-Edm，48 h后用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞的凋亡情況并做統(tǒng)計(jì)分析，以不感染病毒或/和不做PS1145預(yù)處理作為對(duì)照；B：用NF-κB通路抑制劑PS1145預(yù)處理A549細(xì)胞，3 h后感染MOI為0.5的MV-Edm，48 h后收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot檢測p-IκBα、IκBα、PARP以及BAX的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，以不做PS1145預(yù)處理作為對(duì)照。Fig 3 Inhibition of NF-κB signaling pathway promots apoptosis induced by MV-Edm infection (P<0.01). A: A549 cells pretreated with PS1145 for 3 h were infected with MV-Edm (MOI 0.5) for at 24 h, 48 h,and 72 h, and cell apoptosis was quantified using Annexin V/PI; B: The level of p-IκBα,IκBα, PARP and BAX was monitored by immunoblotting 48 h after infection of MVEdm infection with or without IKK inhibitor PS1145.

2.4 抑制NF‐κB信號(hào)通路可以增強(qiáng)MV‐Edm的溶瘤效果 既然抑制NF‐κB信號(hào)通路可以促進(jìn)MV‐Edm感染細(xì)胞的凋亡，因此NF‐κB信號(hào)通路也可能會(huì)影響MV‐Edm感染細(xì)胞的存活情況。我們通過IKK抑制劑PS1145抑制NF‐κB信號(hào)通路，感染MV‐Edm后不同時(shí)間點(diǎn)檢測A549和H1299細(xì)胞的溶瘤效果，結(jié)果如圖4所示，應(yīng)用PS1145抑制NF‐κB信號(hào)通路后感染MV‐Edm，A549和H1299細(xì)胞的存活率明顯降低（P<0.01）。上述結(jié)果說明NF‐κB信號(hào)通路抑制劑與溶瘤麻疹病毒疫苗株聯(lián)用可以增強(qiáng)MV‐Edm的溶瘤效果。

圖4 抑制NF-κB信號(hào)通路可以增強(qiáng)MV-Edm的溶瘤效果（P<0.01）。用NF-κB通路抑制劑PS1145分別預(yù)處理A549和H1299細(xì)胞，3 h后感染MOI為0.5的MV-Edm，48 h時(shí)后用MTT法檢測A549和H1299細(xì)胞的存活率，以不感染病毒或/和不做PS1145預(yù)處理作為對(duì)照。Fig 4 Inhibition of the NF-κB signaling pathway can enhance the oncolytic effect of MV-Edm(P<0.01), A549 and H1299 cells pretreated with PS1145 for 3 h were infected with MV-Edm (MOI 0.5) for at 24 h, 48 h, and 72 h, and cell death was quantified using MTT. *P＜0.05; **P＜0.01

3 討論

盡管溶瘤麻疹疫苗株MV‐Edm因其可靠的安全性和優(yōu)越的溶瘤效果已進(jìn)入多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，但是MV‐Edm的具體溶瘤機(jī)制至今尚未闡明。而明確其溶瘤機(jī)制，對(duì)于不斷優(yōu)化溶瘤病毒治療策略具有極其重要的意義。本研究證實(shí)了MV‐Edm利用其介導(dǎo)的細(xì)胞自噬調(diào)控NF‐κB信號(hào)通路從而拮抗細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步應(yīng)用NF‐κB信號(hào)通路抑制劑PS1145與溶瘤麻疹病毒疫苗株聯(lián)合促進(jìn)人肺癌細(xì)胞A549和H1299凋亡，增強(qiáng)其溶瘤效果。本研究發(fā)現(xiàn)的MV‐Edm溶瘤新機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化MV‐Edm的溶瘤病毒治療提供了新思路。

細(xì)胞凋亡曾被認(rèn)為是MV‐Edm溶瘤作用的主要機(jī)制。在MV‐Edm治療人惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳腺癌的研究中，感染的腫瘤細(xì)胞觀察到了凋亡特異性改變[19,20]。但是，凋亡在介導(dǎo)MV‐Edm溶瘤中的作用尚沒有深入探討，也不清楚是否存在其他溶瘤方式，而闡明這些機(jī)制對(duì)于優(yōu)化MV‐Edm的溶瘤策略具有重要意義。實(shí)際上，在以往的相關(guān)研究中MV‐Edm感染腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致的凋亡都發(fā)生在感染晚期。在MV‐Edm感染的腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡在溶瘤過程中扮演何種角色至今并未闡明。

而NF‐κB在癌癥中發(fā)揮的作用至今仍沒有完全闡明?；罨腘F‐κB在諸如淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等多種癌癥研究中被發(fā)現(xiàn)[21]。NF‐κB通路發(fā)現(xiàn)與腫瘤的復(fù)發(fā)、藥物抵抗和不良預(yù)后相關(guān)[22]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)NF‐κB通路的上游激活物或相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子也具有抗腫瘤作用[23]。因此，NF‐κB究竟是腫瘤抑制還是促進(jìn)，抑或是與腫瘤類型相關(guān)，抑或是抗瘤治療的潛在干擾因素都需要進(jìn)一步的研究。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MV‐Edm感染肺癌細(xì)胞A549和H1299會(huì)激活其NF‐κB通路從而抵抗細(xì)胞凋亡，而抑制NF‐κB通路會(huì)增強(qiáng)其溶瘤效果。

近年來越來越多的研究表明，細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡通路之間存在許多交叉點(diǎn)從而能夠相互影響。研究表明，凋亡相關(guān)蛋白Bcl‐xL或者Bcl‐2能與細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白BECN1相結(jié)合從而拮抗細(xì)胞自噬[24]；凋亡關(guān)鍵分子Caspase‐3可以通過裂解自噬相關(guān)蛋白BECN1從而抑制細(xì)胞自噬[25]；自噬相關(guān)蛋白BECN1通過抑制Caspase‐8的降解或凋亡分子Bid的激活從而拮抗凋亡[26]；線粒體上的Bcl‐xL能夠與自噬相關(guān)蛋白ATG5的裂解片段相互作用進(jìn)而控制細(xì)胞色素C的釋放到胞漿中誘發(fā)細(xì)胞凋亡等[27,28]。這為本研究進(jìn)一步探討MV‐Edm感染腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡提供了思路和理論基礎(chǔ)。

既往許多研究提示細(xì)胞自噬很可能通過降解衰老或損傷的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等緩解外界刺激因素對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)從而保護(hù)細(xì)胞免于或者延緩死亡[29]。Joubert小組[30]發(fā)現(xiàn)基孔肯雅病毒通過誘導(dǎo)自噬延緩Caspase依賴的細(xì)胞凋亡；McLean小組發(fā)現(xiàn)黃病毒感染上皮細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬從而保護(hù)細(xì)胞抵抗凋亡[15]。Richetta等[31]的研究表明，MV‐Edm感染人宮頸癌細(xì)胞HeLa所誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬能抵抗細(xì)胞凋亡。我們既往研究也提示MV‐Edm通過誘導(dǎo)損傷線粒體自噬控制細(xì)胞色素C釋放到胞漿中從而拮抗凋亡關(guān)鍵分子Caspase等誘發(fā)的細(xì)胞凋亡[13]。同樣的，本研究結(jié)果也證實(shí)，在細(xì)胞自噬被抑制后感染MV‐Edm誘導(dǎo)的NF‐κB信號(hào)通路激活受抑制，而抑制NF‐κB信號(hào)通路會(huì)使細(xì)胞凋亡顯著增加。這些研究結(jié)果也許就能部分解釋在以往的研究中為什么細(xì)胞在感染MV‐Edm的相對(duì)晚期才會(huì)有出現(xiàn)凋亡特征。MV‐Edm誘導(dǎo)的自噬可以拮抗細(xì)胞凋亡也許還存在別的可能機(jī)制，這需要更進(jìn)一步的研究。為了提高M(jìn)V‐Edm對(duì)不同種腫瘤細(xì)胞的溶瘤作用，應(yīng)用到不同種腫瘤的臨床治療，仍然需要繼續(xù)研究其他的腫瘤細(xì)胞類型是否也存在同樣的溶瘤機(jī)制。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了MV‐Edm利用其介導(dǎo)的細(xì)胞自噬調(diào)控NF‐κB信號(hào)通路從而拮抗細(xì)胞凋亡，并將NF‐κB信號(hào)通路抑制劑PS1145與MV‐Edm聯(lián)合可以協(xié)同溶瘤麻疹病毒疫苗株抗肺癌。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于不斷發(fā)展和優(yōu)化以MV‐Edm為基礎(chǔ)的溶瘤病毒治療非常重要，對(duì)于其他溶瘤病毒相關(guān)溶瘤機(jī)制的探討以及溶瘤手段的不斷優(yōu)化也提供了有力的借鑒。

Author contributions

Xia M and Dong J conceived and designed the study. Xia M and Meng G performed the experiments. Xia M analyzed the data. Xia M and Meng G contributed analysis tools. Dong J and Xia M provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.