百合的組織培養(yǎng)專利分析

陳佩 馬彧博

(國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作天津中心，天津 300304)

百合是百合科百合屬多年生草本球根植物，百合花姿優(yōu)雅，是世界著名的觀賞花卉之一，全球已發(fā)現(xiàn)110多個(gè)品種，其中55種產(chǎn)于中國(guó)。百合除具有觀賞價(jià)值外，其干燥的肉質(zhì)鱗葉還可食用、藥用，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺，清心安神之功效。傳統(tǒng)的百合繁殖方法主要采用分球、分珠芽、鱗片扦插等。但是上述繁殖方法繁殖系數(shù)低且容易造成品種退化以及病毒的積累[1]，組織培養(yǎng)不受時(shí)間的限制，可以采用多種器官或者組織建立百合的再生體系，從而達(dá)到快速繁殖百合植株的目的。目前主要通過(guò)4種途徑建立百合的再生體系，通過(guò)脫分化形成愈傷組織、再分化形成芽、增殖和生根培養(yǎng)得到再生植株；通過(guò)直接誘導(dǎo)不定芽，對(duì)不定芽進(jìn)行增殖和生根培養(yǎng)得到再生植株；誘導(dǎo)小鱗莖途徑，通過(guò)外植體誘導(dǎo)得到小鱗莖，對(duì)小鱗莖進(jìn)行生根培養(yǎng)；體細(xì)胞胚狀體途徑，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)得到球形胚或者外植體直接形成胚狀體，進(jìn)行分化培養(yǎng)得到再生植株[2]。另外，利用組織培養(yǎng)結(jié)合莖尖培養(yǎng)可以得到脫毒百合，將組織培養(yǎng)與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)合能得到產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)且抗逆性強(qiáng)的百合新品種；將組織培養(yǎng)與多倍體誘變結(jié)合能選育出更多的優(yōu)良品種。本文以百合組織培養(yǎng)技術(shù)為入口進(jìn)行專利檢索和分析，揭示百合組培再生相關(guān)專利脈絡(luò)，為企業(yè)或者研究院所提供信息。

1 百合組織培養(yǎng)技術(shù)中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)情況

在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局自主開發(fā)的專利檢索與服務(wù)系統(tǒng)(S系統(tǒng))和Incopat專利檢索平臺(tái)上以關(guān)鍵詞結(jié)合分類號(hào)檢索獲取專利信息，共得到447篇專利文獻(xiàn)。由于專利法規(guī)定自申請(qǐng)日起滿18個(gè)月即行公布，也可以根據(jù)申請(qǐng)人的請(qǐng)求早日公布，即專利公布時(shí)間相對(duì)滯后，因此2019年及以后的數(shù)據(jù)僅作參考。

1.1 申請(qǐng)趨勢(shì)分析

百合組培技術(shù)專利在中國(guó)的申請(qǐng)量分布見圖1。

圖1 百合種質(zhì)技術(shù)專利在中國(guó)的申請(qǐng)分布

由圖1可知，2002—2009年間，百合組培技術(shù)專利申請(qǐng)量較低；2011—2014年申請(qǐng)量處于增長(zhǎng)階段。尤其在2014年達(dá)到申請(qǐng)量的最高峰，可能與國(guó)家扶持農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展以及支持農(nóng)業(yè)特色農(nóng)產(chǎn)品發(fā)展的政策相關(guān)。如，國(guó)務(wù)院以國(guó)發(fā)〔2012〕10號(hào)印發(fā)《關(guān)于支持農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化龍頭企業(yè)發(fā)展的意見》。另外，百合還可作為中藥，國(guó)家也將中藥材的發(fā)展作為經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要舉措，如，國(guó)家2015年出臺(tái)的《中藥材保護(hù)和發(fā)展規(guī)劃(2015—2020年)》、2016年印發(fā)的《中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要(2016—2030年)》[3]。隨著國(guó)家鄉(xiāng)村振興的實(shí)施，百合的組織培養(yǎng)技術(shù)也會(huì)不斷增長(zhǎng)。

1.2 百合組織培養(yǎng)專利中國(guó)申請(qǐng)主要申請(qǐng)人分析

由圖2可以看出，百合組培專利相關(guān)的申請(qǐng)人主要是國(guó)內(nèi)的高校和研究所，其中昆明理工大學(xué)和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所申請(qǐng)量較多，主要是因?yàn)樵颇侠ッ鞫纺蠂?guó)際花卉市場(chǎng)是亞洲第1花卉批發(fā)市場(chǎng)，百合花作為市場(chǎng)需求量廣泛的花卉之一，在云南種植廣泛。另外，北京林業(yè)大學(xué)、浙江大學(xué)以及長(zhǎng)江師范學(xué)院申請(qǐng)量相當(dāng)?？梢姡瑹o(wú)論是北方、南方還是中部地區(qū)對(duì)百合組培研究都比較多。

圖2 百合組培技術(shù)專利主要申請(qǐng)人及申請(qǐng)量

1.3 技術(shù)領(lǐng)域分布

通過(guò)統(tǒng)計(jì)專利設(shè)計(jì)的國(guó)際專利分類號(hào)(IPC)，對(duì)百合組培技術(shù)領(lǐng)域進(jìn)行分析，如表1所示。百合主要的分類號(hào)是A01H，新植物或獲得新植物的方法，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生；C12N，微生物或酶，其組合物，繁殖、保藏或維持微生物，變異或遺傳工程，培養(yǎng)基；C12Q包含酶、核酸或微生物的測(cè)定或檢驗(yàn)方法。也有一定數(shù)量關(guān)于A01G園藝；蔬菜、花卉、稻、果樹、葡萄、啤酒花或海菜的栽培。上述4個(gè)領(lǐng)域涵蓋了組織培養(yǎng)再生，百合的遺傳轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)基、百合育種中的檢測(cè)以及百合的種植方向。

圖3 技術(shù)領(lǐng)域分布

2 專利技術(shù)研究路線分析

2.1 外植體的選擇

百合組培再生中鱗片是普遍采用的外植體，但鱗莖在土壤中帶病毒較多，病毒在植株體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制繁殖，在組織培養(yǎng)中容易出現(xiàn)真菌污染，同時(shí)繼代培養(yǎng)的過(guò)程中也較容易出現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌的再次污染，因此莖段、種胚/種子、花藥、花絲也是常見的外植體類型。如，CN110810240A公開了以健康母株的莖段作為外植體，誘導(dǎo)不定芽和對(duì)不定芽增殖培養(yǎng)得到無(wú)菌苗的方法；CN110771501A公開了以百合種子進(jìn)行萌發(fā)、分化得到無(wú)菌幼苗，并對(duì)幼苗進(jìn)行增殖、鱗莖誘導(dǎo)和生根、煉苗移栽的方法；CN108633743A公開了以百合花藥為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)再生的方法；CN103798142A公開了以百合花絲為外植體，誘導(dǎo)胚性愈傷組織得到污染率低、誘導(dǎo)率高、再生能力強(qiáng)、增殖率高的再生方法。

2.2 再生途徑

在適宜的條件下培養(yǎng)莖段、莖尖、芽等器官，利用外植體已經(jīng)存在的芽器官，通過(guò)以芽繁芽的再生方法得到完整植株是百合常見的器官型再生方式，在理論上該途徑再生得到的后代基因型與母體基本一致，可較好地保持母本特性。如，CN108834895A公開了以百合莖尖為外植體，在MS加6-BA加NAA培養(yǎng)基中進(jìn)行芽誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)培養(yǎng)得到再生植株的方法，該方法再生率高；CN106718873A公開了以百合的莖尖或腋芽為外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)、不定芽增殖，繁殖系數(shù)可達(dá)4～5倍。

利用各分生組織或器官在添加植物激素的培養(yǎng)基中進(jìn)行脫分化、再分化的愈傷途徑也是百合常見的器官發(fā)生型再生途徑。如，CN108633743A公開了以百合花藥為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到35%以上；CN108450333A公開了以百合鱗片或珠芽接種在MS加6-BA加NAA加KT加2,4-D進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)和不定芽的分化，20d就能得到愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)71%；CN107173236A公開了以百合種子為外植體，接種在1/2MS加2,4-D加NAA加6-BA加殺菌中草藥中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)的方法，該方法提高了百合愈傷組織的抗感染能力。

百合是常見的球根花卉，利用外植體在合適的條件下直接誘導(dǎo)形成帶根的小鱗莖是百合再生中特殊的小鱗莖途徑。CN107396835A公開了以百合中部或者基部鱗片為外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)、鱗莖增殖的再生方法；CN107736251A公開了以鱗莖為外植體，在MS加IBA加細(xì)胞分裂素加油菜素內(nèi)酯加茉莉酸甲酯誘導(dǎo)小鱗莖，并對(duì)鱗莖進(jìn)行膨大、生根、催芽的再生方法，該方法提高了繁殖系數(shù)、縮短了繁殖周期；CN10754907A公開了對(duì)百合莖桿葉腋葉面噴施吲哚乙酸和表油菜素內(nèi)酯的混合物進(jìn)行莖生小鱗莖誘導(dǎo)、小鱗莖催芽生長(zhǎng)的方法，每株可誘導(dǎo)6～10個(gè)小鱗莖，繁殖系數(shù)高。

在離體條件下，外植體產(chǎn)生類似胚胎的發(fā)生和發(fā)育的過(guò)程是百合再生中的體胚誘導(dǎo)途徑，體細(xì)胞胚減少了植株的變異性。如，CN110972955A公開了以葉為外植體在MS加NAA加2,4-D/6-BA/PIC進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)，將胚性愈傷組織在MS加6-BA加NAA進(jìn)行增殖培養(yǎng)得到體細(xì)胞胚的再生方式；CN108464242A公開了以百合無(wú)菌苗的外層鱗片接種于MS加PIC加ABA的培養(yǎng)基中進(jìn)行原胚誘導(dǎo)，在MS加PIC加NAA進(jìn)行體胚增殖培養(yǎng)，并對(duì)體胚進(jìn)行萌發(fā)和成苗培養(yǎng)的方法，該方法體胚誘導(dǎo)時(shí)間短、體胚質(zhì)量佳。

2.3 組織培養(yǎng)在種質(zhì)資源和育種中的應(yīng)用

2.3.1 組織培養(yǎng)與脫毒

百合作為球根花卉，常采用鱗莖、鱗片等進(jìn)行繁殖，容易發(fā)生病毒感染，病毒病嚴(yán)重影響了百合的生產(chǎn)，常見的病毒病有黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒。通過(guò)組織培養(yǎng)可得到脫毒植株，將組織培養(yǎng)與莖尖培養(yǎng)、熱處理以及化學(xué)試劑結(jié)合進(jìn)行脫毒。如，CN11280059A公開了以中內(nèi)層健康的鱗片為外植體培養(yǎng)得到無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗小鱗片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，隨后分化誘導(dǎo)得到無(wú)毒的成苗，該方法能快速高效得到脫毒苗；CN110268980A公開了以健康鱗莖為外植體得到無(wú)菌苗，再將無(wú)菌苗進(jìn)行熱處理，以熱處理的莖尖為外植體進(jìn)行脫毒培養(yǎng)得到脫毒苗。

2.3.2 組織培養(yǎng)與離體保存

離體培養(yǎng)的植株、器官或細(xì)胞通過(guò)限制、延緩或停止其生長(zhǎng)的方法保存，占據(jù)空間小，便于交流利用，避免種質(zhì)丟失。高滲透壓保存是百合種質(zhì)資源保存中常見的1種方式。如，CN101796925A公開了將誘導(dǎo)再生的鱗莖芽切去芽頂部和部分基部組織后，接種在1/2MS加NAA加PP333加甘露醇加AC的離體保存與試管鱗莖膨大同步培養(yǎng)基中，使得離體保存的效率提高50%～60%。通過(guò)降低溫度減弱培養(yǎng)物的生命活動(dòng)從而達(dá)到抑制生長(zhǎng)、保存種質(zhì)的目的也是百合種質(zhì)保存中常見的方式。如，CN110367125A公開了在百合鱗莖培養(yǎng)期間進(jìn)行間隔性的低溫刺激，隨后恢復(fù)常溫培養(yǎng)小鱗莖，再將百合鱗莖在常溫、低溫、超低溫條件下保存，通過(guò)對(duì)百合鱗莖提前進(jìn)行馴化，避免其在超低溫條件保存時(shí)出現(xiàn)凍傷，導(dǎo)致活性喪失；CN104255711A公開了采用玻璃化超低溫保存方法對(duì)百合胚性愈傷組織進(jìn)行保存，通過(guò)向冷凍保護(hù)劑中添加納米材料有效提高保護(hù)劑的粘度和熱導(dǎo)率，使得保存后的恢復(fù)生長(zhǎng)率顯著提高。

2.3.3 組織培養(yǎng)與多倍體誘變

遠(yuǎn)緣雜交是百合育種的重要手段，然而遠(yuǎn)緣雜種間由于染色體不能正常分離表現(xiàn)出不育，限制了遠(yuǎn)緣雜交在百合育種中的應(yīng)用，通過(guò)秋水仙素、氟樂(lè)靈對(duì)花藥培養(yǎng)得到的單倍體加倍或者體細(xì)胞染色體加倍可有效解決這一問(wèn)題。如，CN106106152A公開了在誘導(dǎo)前采用秋水仙素對(duì)材料進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，繼而對(duì)不定芽進(jìn)行繼代培養(yǎng)分離嵌合體，之后進(jìn)行叢生芽生長(zhǎng)和生根培養(yǎng)得到純合四倍體材料，該方法誘導(dǎo)率高，四倍體植株生長(zhǎng)正常、倍性穩(wěn)定，可作為新品種培育的重要種質(zhì)材料。另外，百合三倍體具有特異的品種和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，常規(guī)的方法是將四倍體和二倍體雜交，但是該方法周期短，采用組織培養(yǎng)結(jié)合誘變能快速得到三倍體百合。如，CN1579144A公開了采用秋水仙素點(diǎn)滴法處理花芽，按照常規(guī)栽培技術(shù)繼續(xù)培養(yǎng)上述植株，將三倍體胚接種在MS加6-BA加GA3培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)、染色體鑒定，將最終確定的三倍體植株的鱗片接種在MS加6-BA加NAA繼代培養(yǎng)，選育出三倍體百合新類型。

2.3.4 組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化

百合同時(shí)具有觀賞、食用、藥用價(jià)值，其種質(zhì)資源遺傳變異豐富，培育花型優(yōu)美、花色豐富，抗鹽、堿、旱、病蟲害等抗逆性強(qiáng)的百合品種是當(dāng)前市場(chǎng)的需求，然而傳統(tǒng)的雜交育種存在周期長(zhǎng)的問(wèn)題。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是改良植物的有效手段。如，CN1561697A公開了1種百合遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的方法，其以百合鱗莖或花絲為外植體建立高頻的再生系統(tǒng)，通過(guò)抗生素敏感試驗(yàn)確定了篩選濃度，建立了高效的轉(zhuǎn)化體系；CN101302519A公開了以麝香百合的鱗莖為外植體得到無(wú)菌苗，從半夏中克隆pta基因構(gòu)建載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pta基因轉(zhuǎn)化百合葉片得到抗性再生植株，最終獲得抗蚜蟲型提高的轉(zhuǎn)基因百合；CN101302518A公開了從百合中克隆Liaco基因的反義片段，構(gòu)建表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將antiLlaco轉(zhuǎn)入百合得到轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)衰老試驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)化植株的耐衰老性，得到壽命延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因百合植株。

3 結(jié)語(yǔ)

百合具有較高的商品價(jià)值，通過(guò)組織培養(yǎng)可快速得到再生百合幼苗，目前對(duì)百合高效再生體系的研究較多，如何進(jìn)一步優(yōu)化再生方法得到繁殖系數(shù)高、周期短、成本低的再生體系，以及進(jìn)一步將組織培養(yǎng)與雜交育種、誘變育種、種質(zhì)資源保存、脫毒、遺傳轉(zhuǎn)化相結(jié)合是百合組培工廠化生產(chǎn)中的研究方向。