不同濃度的葛根多糖對(duì)小鼠腸道菌群的影響

陳 融，劉 博，陳 凱，楊銳樂(lè)，王 米

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用化學(xué)藥物及制劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

腸道菌群是腸道微環(huán)境的重要組成部分，數(shù)量與人體細(xì)胞比例接近1:1，對(duì)于宿主維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答具有重要意義[1-2]。研究表明，與宿主基因相比，日糧對(duì)于腸道菌群組成的影響更大，通過(guò)飲食干預(yù)能夠影響到菌群結(jié)構(gòu)，具有疾病預(yù)防和治療的作用[3-6]，這為功能性食品及添加劑等產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)提供了更多思路。

葛根為豆科葛屬植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，在我國(guó)分布廣泛。植物多糖具有較強(qiáng)的生物活性，在抗病毒、抗腫瘤、降血糖和血脂以及促進(jìn)免疫功能的等方面表現(xiàn)較好[7-9]。葛根多糖具有較強(qiáng)的體外抗氧化、抗糖基化以及免疫調(diào)節(jié)等活性[10-12]。但多糖大多難以直接被機(jī)體直接吸收，其活性發(fā)揮的作用機(jī)制可能與腸道菌群有關(guān)，如通過(guò)其代謝產(chǎn)物（如短鏈脂肪酸）或增加有益菌比例等方式參與糖代謝紊亂和胃腸道功能障礙等疾病治療[13-14]。本研究通過(guò)GC-MS、Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)評(píng)價(jià)葛根多糖對(duì)小鼠腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的影響，有助于葛根多糖的作用機(jī)制的闡明和對(duì)其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)小鼠30 只，雄性，體重為（17.00±1.00）g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（SCXK<滬>2018-0004），在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。

1.2 藥物及試劑 葛根購(gòu)自上海雷允上藥業(yè)有限公司（批號(hào)：2018031201）。短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品（乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。石油醚、乙醇、乙醚等試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器 全自動(dòng)高壓滅菌鍋（ALP，日本）；ESCO 生物安全柜（新加坡Esco 科技有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR:Fourier transform infrared spectroscopy）；Thermo Nicolet iS10；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS：Gas Chromatography-Mass Spectrometercomputer）；Thermofisher，ISQ7000。

1.4 多糖的提取 葛根經(jīng)石油醚脫脂脫色后，烘干粉碎，稱(chēng)取100 g，容器中加入1 L 沸水，保持微沸4 h，4 000 r/min 離心20 min，收集上清。將殘?jiān)尤敕兴兄? h，再次收集上清。將2 次離心得到的上清液合并，在60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。將濃縮的多糖溶液和無(wú)水乙醇以1:4 的體積比混合，過(guò)夜，離心收集沉淀，反復(fù)醇沉，將沉淀烘干，得到葛根粗多糖，通過(guò)苯酚-硫酸法[15]測(cè)得糖含量為55%。

1.5 紅外光譜分析 取1 mg 葛根多糖與200 mg 溴化鉀干粉混合，研磨后壓制成約1 mm 厚度的圓片[16]，用傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜儀在4 000～400 cm-1的頻率范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 適應(yīng)期結(jié)束后，將30 只小鼠按照體重隨機(jī)分為3 組(n=10)，分別為正常對(duì)照組、低濃度葛根多糖組、高濃度葛根多糖組。低濃度組的葛根多糖濃度為12.5 mg/kg，高濃度組的葛根多糖濃度為100 mg/kg，對(duì)照組給予等量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)給藥14 d。稱(chēng)重小鼠體重和食物消耗量，最后一次灌胃24 h 后處死小鼠，稱(chēng)取胸腺、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和睪丸的重量，收集盲腸內(nèi)容物，-80℃保存，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.7 短鏈脂肪酸濃度檢測(cè) 取適量的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和己酸，用乙醚溶液（含內(nèi)標(biāo)2-甲基戊酸）配置濃度為400、200、100、50、25、10、5、1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)量100 mg 的盲腸內(nèi)容物（n=5），加入0.8 mL 超純水溶解。12 000 r/min 離心20 min，取上清液0.4 mL，加入0.1 mL 的50% H2SO4和0.5 mL 的乙醚溶液（含內(nèi)標(biāo)2-甲基戊酸）。4℃放置30 min，可保存在-20℃，用GC-MS 檢測(cè)。

1.8 腸道菌群多樣性分析 盲腸內(nèi)容物樣品由上海派森諾生物技術(shù)公司，使用高通量測(cè)序技術(shù)在Illumina MiSeq/NovaSeq 平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用GraphPad Prism 8 進(jìn)行單因素方差分析，并用Turkey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，P<0.05 表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析 葛根多糖有明顯的糖類(lèi)特征吸收峰。如圖1 所示，在波數(shù)3 416 cm-1處有明顯的O-H 吸收峰，在2 933 cm-1處有C-H 的伸縮振動(dòng)，這個(gè)區(qū)域的吸收峰是糖類(lèi)的特征峰，在1 629 cm-1處有C=O 非對(duì)稱(chēng)的伸縮振動(dòng)峰，1 442 cm-1和1 254 cm-1處是C-H 的變角振動(dòng)引起的吸收峰，1 019 cm-1處存在吡喃型糖環(huán)吸收峰。

圖1 葛根多糖的紅外光譜

2.2 小鼠體重變化及器官指數(shù) 如圖2 及表1 所示，各組小鼠體重和臟器指數(shù)無(wú)顯著差異。

圖2 不同濃度的葛根多糖對(duì)于小鼠體重的影響

表1 不同濃度的葛根多糖對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 mg/g

2.3 短鏈脂肪酸濃度 如表2 所示，與對(duì)照組相比，低濃度葛根多糖組的異丁酸和異戊酸濃度均顯著增高，高濃度葛根多糖組的異戊酸濃度顯著增高，而其余短鏈脂肪酸在組間均無(wú)顯著變化。

表2 不同濃度的葛根多糖對(duì)小鼠盲腸內(nèi)短鏈脂肪酸濃度的影響 μg/g

2.4 腸道菌群分析

2.4.1 Alpha 多樣性和Beta 多樣性 表3 表明，低濃度葛根多糖組的豐富度（Chao1）、多樣性（Shannon）、均勻度（Pielou's evenness）、覆蓋度（Goods_coverage）和進(jìn)化的多樣性（Faith’ PD）均顯著高于對(duì)照組。主坐標(biāo)分析（Principal Coordinate Analysis，PCoA）是對(duì)多維的微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，從而在不同的角度表征這兩個(gè)樣本間的群落差異。從圖3 可以看出，低濃度葛根多糖組與對(duì)照組的群落組成相似度均顯著低于高濃度葛根多糖組，即低濃度葛根多糖對(duì)小鼠腸道菌群組成影響更大。

表3 不同濃度的葛根多糖對(duì)Alpha 多樣性指數(shù)的影響

圖3 基于加權(quán)與未加權(quán)UniFrac 距離的PCoA

2.4.2 腸道菌群差異顯著分析 根據(jù)韋恩圖（圖4-A）分析，3 組共有1 128 種常見(jiàn)OUT（Operational Taxonomic Units），其中對(duì)照組和低濃度葛根多糖組共有1 576 種，對(duì)照組和高濃度葛根多糖組共有1 628 種，低濃度葛根多糖組和高濃度葛根多糖組共有1 785 種OTU，對(duì)照組特有2 238 種OTU，低濃度葛根多糖組特有4 326 種OTU，高濃度葛根多糖組特有2 900 種OTU。

LEfSe 分析（圖4-B、C）展示了各組腸道菌菌群在不同分類(lèi)單位上的差異，圖5 是在門(mén)和屬水平上的各組腸道菌群相對(duì)豐度的顯著性差異分析，結(jié)果表明，在門(mén)水平上，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、變形桿菌門(mén)（Proteobacteria）和TM7 是主要優(yōu)勢(shì)物種，其中，與對(duì)照組相比，低濃度葛根多糖組的放線菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低，高濃度葛根多糖組的變形桿菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著增加。在屬水平上，棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）是優(yōu)勢(shì)物種，其中，與對(duì)照組相比，低濃度葛根多糖組的棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、丁酸弧菌屬（Anaerostipes）和產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）的相對(duì)豐度顯著降低，而糞球菌屬（Coprococcus）、厭氧棍狀菌屬（Anaerotruncus）和顫螺旋菌屬的相對(duì)豐度顯著增加，高濃度葛根多糖組的糞球菌屬的相對(duì)豐度增加，產(chǎn)堿桿菌屬的相對(duì)豐度顯著降低。

3 討 論

圖4 葛根多糖對(duì)于腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

圖5 盲腸菌群相對(duì)豐度變化圖

本研究結(jié)果表明，2 種濃度的葛根多糖對(duì)小鼠的體重和臟器指數(shù)都無(wú)影響，說(shuō)明該濃度對(duì)小鼠是安全的。短鏈脂肪酸指具有1～6 個(gè)碳原子數(shù)的脂肪酸，是腸道菌群代謝最終產(chǎn)物之一。短鏈脂肪酸不僅對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)十分重要，還能維護(hù)腸道黏膜屏障以及影響葡萄糖代謝和脂質(zhì)代謝[6,17-19]。異丁酸和異戊酸也被稱(chēng)為支鏈脂肪酸，不同于其他短鏈脂肪酸，被作為蛋白質(zhì)分解代謝的一種標(biāo)志物，但由于分解過(guò)程中有害副產(chǎn)物的釋放，支鏈脂肪酸濃度降低被視為對(duì)宿主健康有益[20-21]。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，低濃度葛根多糖能顯著降低異丁酸和異戊酸濃度，高濃度葛根多糖能顯著降低異戊酸濃度。另一方面，本試驗(yàn)還探究了2 種濃度葛根多糖對(duì)于腸道菌的影響。Alpha 多樣性和Beta 多樣性分析常用以綜合評(píng)價(jià)腸道菌群的總體多樣性[22-23]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群多樣性較低與骨髓移植后患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)存在顯著關(guān)聯(lián)[24]。在Alpha 多樣性分析中，不同濃度的葛根多糖均能提高Chao1、Shannon、Pielou's evenness 等指數(shù)，而且低濃度葛根多糖組呈顯著增加。在Beta 多樣性分析中，低濃度葛根多糖組與對(duì)照組的群落組成相似度均低于葛根多糖高濃度組，即低濃度的葛根多糖對(duì)小鼠腸道菌群組成影響更大。類(lèi)似的，與對(duì)照組相比，不同濃度的葛根多糖處理組的總OTU 數(shù)以及特有OTU數(shù)也有增長(zhǎng)。結(jié)果表明葛根多糖會(huì)提高腸道菌的多樣性，其中低濃度葛根多糖組尤為顯著。

在門(mén)水平上，與對(duì)照組相比，低濃度葛根多糖組的放線菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低，高濃度葛根多糖組的變形桿菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著增加。目前認(rèn)為厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)（F/B）較高與肥胖和2 型糖尿病相關(guān)[25-26]。而本研究發(fā)現(xiàn)低濃度葛根多糖將F/B 從2.82 降低到1.67。在屬水平上，低濃度葛根多糖能夠顯著提高糞球菌屬、厭氧棍狀菌屬、顫螺旋菌屬的相對(duì)豐度，而棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬、丁酸弧菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬的相對(duì)豐度顯著降低。高濃度葛根多糖能夠顯著提高糞球菌屬的相對(duì)豐度，使產(chǎn)堿桿菌屬的相對(duì)豐度顯著降低。其中，棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬均包含機(jī)會(huì)致病菌或致病菌，如白喉棒狀桿菌（Corynebacterium.diphiheriae）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus.aureus）、糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes.faecalis）等[27-29]。糞球菌屬、厭氧棍狀菌屬、顫螺旋菌屬和丁酸弧菌屬細(xì)菌參與丁酸的產(chǎn)生，厭氧棍狀菌屬還被認(rèn)為是抗肥胖的有益菌屬[30]。丁酸是腸道菌群的一種有益的重要代謝產(chǎn)物，不僅作為腸上皮細(xì)胞的能量來(lái)源，還增加其屏障功能，對(duì)于結(jié)腸炎有改善作用[31-32]。Gao 等[33]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂飲食的小鼠口服丁酸鹽可以通過(guò)增加能量消耗而防止胰島素抵抗和肥胖的發(fā)生。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究從葛根中提取出一種水溶性多糖，在小鼠試驗(yàn)中未表現(xiàn)出明顯毒性，且可降低盲腸內(nèi)異丁酸和異戊酸的濃度，顯著降低條件致病菌屬（棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬），提高有益菌屬（顫螺旋菌屬、糞球菌屬、厭氧棍狀菌屬），其中，低濃度葛根多糖效果最佳。