布舍瑞林在奶牛同期發(fā)情-定時(shí)輸精中的應(yīng)用效果分析

顧文源，蘇碩青，劉 玉，馮春濤，藺惠良，余文莉,3,4*，李樹靜,3,4*

（1.石家莊天泉良種奶牛有限公司，河北石家莊 050200；2.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北石家莊 050053；3.河北省奶牛良種繁育工程技術(shù)研究中心，河北石家莊 050200；4.河北省牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北石家莊 050200）

定時(shí)輸精（TimEd Artifical InsEmination，TAI）是根據(jù)家畜的繁殖和調(diào)控規(guī)律，利用外源激素對(duì)母畜批量處理，使母畜的發(fā)情、排卵具有可控性和一致性[1]，以確保每頭符合條件的奶牛都能在理想的產(chǎn)后間隔內(nèi)受精。Ovsynch 是第一個(gè)廣泛使用的奶牛定時(shí)輸精程序[2]，其主要使用促性腺激素釋放激素（GnRH）和氯前列烯醇鈉（PG）2 種激素，通過調(diào)控卵巢發(fā)育使處于不同發(fā)育階段的卵泡達(dá)到同時(shí)排卵的效果，可直接進(jìn)行人工授精[3]。采用同期排卵和定時(shí)輸精程序可提高高產(chǎn)泌乳奶牛首次配種的參配率和每次人工授精的受胎率[4]。

在集中管理的高產(chǎn)奶牛群中，高產(chǎn)奶量與行為發(fā)情表現(xiàn)呈負(fù)相關(guān)，這表明無論是否檢測(cè)發(fā)情，定時(shí)輸精都可作為同步方案的一部分。輸精前注射PGF2α和GnRH 或其類似物可對(duì)黃體和卵泡進(jìn)行調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)同步排卵[5]。在美國(guó)至少有5 種GnRH 類似物的產(chǎn)品應(yīng)用于奶牛同期發(fā)情-定時(shí)輸精[2]。布舍瑞林（Buserelin）是GnRH的人工合成類似物，作為一種新的激素藥品應(yīng)用于同期發(fā)情處理，其作用于垂體，調(diào)控機(jī)理與GnRH 相同；布舍瑞林活性強(qiáng)，半衰期比GnRH 長(zhǎng)。因布舍瑞林促黃體生成激素的能力強(qiáng)于促卵泡激素的釋放，又被稱為黃體生成素釋放激素[6-7]。本研究通過分析布舍瑞林對(duì)試驗(yàn)?zāi)膛Ｉ臣に貪舛取⒙雅莅l(fā)育合格率及受胎率的影響，評(píng)估其在奶牛同期發(fā)情-定時(shí)輸精中的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為177 頭14～15 月齡、頭胎產(chǎn)后（53±3）d 子宮復(fù)舊良好的荷斯坦泌乳牛。

1.1.2 試劑 凍精為進(jìn)口荷斯坦奶牛冷凍精液。GnRH 的生產(chǎn)批號(hào)為B200601，規(guī)格為100 μg；布舍瑞林主要成分為促性腺激素釋放激素改造的多肽，批號(hào)為190601，規(guī)格為40 μg；PG 生產(chǎn)批號(hào)為1911008，規(guī)格為0.322 mg。3 種試驗(yàn)藥品均購自寧波三生生物科技有限公司。所用激素類藥品均在有效期內(nèi)，按使用說明貯存。

1.1.3 主要儀器、設(shè)備 輸精槍（蔣氏動(dòng)物用品有限公司）、臺(tái)式離心機(jī)（型號(hào)為SC-04，購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）、獸用B 超儀（型號(hào)HS-101V，Honda ElEctronics Co Ltd）、輸精硬外套和軟外套、一次性5 mL 注射器、采血針、含有促凝劑的真空采血管、15 mL 離心管。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 同期發(fā)情-定時(shí)輸精、采血及血清生殖激素測(cè)定實(shí)驗(yàn)Ⅰ：隨機(jī)選擇21 頭產(chǎn)后（53±3）d 的荷斯坦泌乳牛，分為陰性對(duì)照組、藥物對(duì)照組和試驗(yàn)組。所有試驗(yàn)動(dòng)物均采用Ovsynch（079）同期發(fā)情-定時(shí)輸精方案，方案見表1。陰性對(duì)照組用10 mL 生理鹽水處理，藥物對(duì)照組用100 μg GnRH 處理，布舍瑞林組用20 μg 布舍瑞林處理，在第2 次注射布舍瑞林/GnRH/生理鹽水后，在24 h 內(nèi)，每隔2 h 按照無菌采集的標(biāo)準(zhǔn)在牛頸靜脈部位用75%酒精棉球進(jìn)行消毒，用無菌采血針采集5 mL 血液到含有促凝劑的真空管中，5 000 g×離心15 min，在超凈工作臺(tái)中吸取血清于無菌離心管，在-20℃條件下密封保存[2]，將血清送到北京萊博泰瑞科技發(fā)展有限公司，通過放射免疫分析法檢測(cè)血清中促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P4）激素濃度。

1.2.2 同期發(fā)情-定時(shí)輸精、卵泡分級(jí)、受胎檢查方法實(shí)驗(yàn)Ⅱ：隨機(jī)選擇40 頭產(chǎn)后（53±3）d 的荷斯坦泌乳牛，布舍瑞林組分別用10、20 μg 布舍瑞林處理，對(duì)照組用100 μg GnRH 處理。所有試驗(yàn)動(dòng)物均采用Ovsynch（079）同期發(fā)情-定時(shí)輸精方案，見表1。在第9 天注射藥物后16～18 h 利用獸用B 超儀檢測(cè)卵泡發(fā)育情況，直徑1.0～2.5 cm 的卵泡為合格卵泡，大于2.5 cm 的卵泡定為卵泡囊腫，無卵泡和卵泡囊腫定為無排卵。對(duì)卵泡質(zhì)量合格的牛進(jìn)行輸精（n=40 頭），或模擬生產(chǎn)流程不經(jīng)檢測(cè)直接輸精（n=116 頭）。人工授精后第30 天利用B 超儀檢測(cè)牛的受胎情況（P/AI）。

1.2.3 布舍瑞林對(duì)荷斯坦奶牛定時(shí)輸精的效果分析 依據(jù)實(shí)驗(yàn)Ⅱ結(jié)果，選擇116 頭產(chǎn)后（53±3）d 子宮復(fù)舊良好的泌乳荷斯坦牛分成布舍瑞林組和GnRH 組，按表1方案進(jìn)行處理，所有同期發(fā)情處理牛不進(jìn)行發(fā)情觀察和卵巢檢查，直接進(jìn)行定時(shí)輸精。在人工授精后第30 天用獸用B 超儀檢測(cè)受胎頭數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 均值數(shù)據(jù)采用SPSS 20 軟件單因素方差分析，百分率采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.01 表示差異極顯著，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 布舍瑞林對(duì)荷斯坦奶牛體內(nèi)生殖激素水平的影響分析 由圖1 可見，在相同的采血時(shí)間點(diǎn)，3 組間FSH、LH、P4的濃度均無顯著差異；而生理鹽水組在24 h 的E2濃度顯著高于GnRH 組和布舍瑞林組，其他2 組間差異不顯著。

在不同的采血時(shí)間點(diǎn)，3 組FSH、LH、E2、P4激素存在一定差異。GnRH 組4 h 時(shí)的FSH 濃度顯著高于22 h 和24 h，6 h 顯著高于22 h；而生理鹽水組內(nèi)和布舍瑞林組內(nèi)各采血時(shí)間點(diǎn)的濃度值均無顯著差異。GnRH組和布舍瑞林組均在第2 次注射后4 h 時(shí)FSH 達(dá)到最高濃度，而生理鹽水組的FSH 在16 h 達(dá)到最高濃度。

生理鹽水組22 h 時(shí)的LH 濃度極顯著高于0～18 h，24 h 顯著高于0、2、8、12 h；GnRH 組22 h 的LH 濃度極顯著高于2、4、12 h，顯著高于0、6、8、10、14、16、18 h；布舍瑞林組20 h 極顯著高于4、6、8、10 h，顯著高于0、2、12、14、16、22、24 h，22 h 顯著高于4、6、10 h，24 h 顯著高于4、6、8、10 h。布舍瑞林組LH 濃度達(dá)到最高峰值比生理鹽水組和GnRH組提前了2 h。

表1 同期發(fā)情-定時(shí)輸精方案

各組內(nèi)各采血時(shí)間點(diǎn)E2濃度之間差異均不顯著。GnRH 組0、2、4、8 h 時(shí)的P4濃度極顯著低于14 h，6 h 顯著低于14 h，0、4 h 顯著低于20 h，4 h 顯著低于22 h；布舍瑞林組0、2、8 h 顯著低于18 h；生理鹽水組內(nèi)各采血時(shí)點(diǎn)的濃度值均無顯著差異。布舍瑞林組在第2 次注射后0 h，即PG 注射后48 h，E2達(dá)到最高濃度，P4達(dá)到最低濃度，而生理鹽水組和GnRH 組分別延遲24 h/4 h 和10 h/4 h（E2/P4）。

圖1 外源激素處理后母牛血清中FSH、LH、E2、P4的濃度變化

2.2 不同布舍瑞林劑量對(duì)荷斯坦泌乳牛同期發(fā)情處理的效果分析如表2 所示，10 μg 布舍瑞林組、20 μg 布舍瑞林組和GnRH 組的無排卵率無顯著差異；20 μg 布舍瑞林組受胎率顯著高于10 μg 布舍瑞林組，其他各組差異不顯著。

表2 布舍瑞林不同劑量及GnRH 處理對(duì)奶牛同期發(fā)情定時(shí)輸精效果的影響

2.3 布舍瑞林對(duì)荷斯坦奶牛定時(shí)輸精的效果分析 如表3 所示，在檢測(cè)卵泡和不檢測(cè)直接輸精的情況下，布舍瑞林20 μg 組受胎率略高于GnRH 組（P>0.05）。

表3 布舍瑞林對(duì)奶牛受胎率的影響

3 討 論

母畜在正常的發(fā)情到排卵之間，F(xiàn)SH、LH、E2、P4濃度會(huì)發(fā)生一系列密切關(guān)聯(lián)的消長(zhǎng)變化。理論上，在基于GnRH 的同期發(fā)情定時(shí)輸精方案中，第1 次注射GnRH（GnRH1）后將釋放LH，使優(yōu)勢(shì)卵泡排卵，并使卵泡發(fā)育波同步，卵泡發(fā)育的同步波產(chǎn)生排卵卵泡。第2 次注射GnRH（GnRH2）是在注射PG 后進(jìn)行的，目的是釋放LH，并使GnRH1 處理產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)卵泡排卵[2]。張賀[8]研究發(fā)現(xiàn)，注射GnRH 外源激素不僅引起血漿中LH 水平明顯升高，F(xiàn)SH 水平也明顯升高。本研究中，GnRH 組和布舍瑞林組均在第2 次注射后4 h 時(shí)FSH 達(dá)到最高濃度，而生理鹽水組的FSH 在16 h 達(dá)到最高濃度，3 組內(nèi)的FSH 最低濃度與LH 最高濃度均同時(shí)出現(xiàn)，但布舍瑞林組均比其他2 組提前2 h（20 h vs 22 h）。

多項(xiàng)研究表明，在Ovsynch 程序中，GnRH1 排卵可改善情期受胎率，原因在其第1 次注射GnRH 后間接促進(jìn)了母牛體內(nèi)LH 和FSH 的釋放，再通過注射PG 溶解發(fā)情周期的黃體，縮短黃體周期，牛群集中進(jìn)入下一個(gè)發(fā)情周期，再進(jìn)行第2 次注射GnRH 既能維持卵巢中卵泡的數(shù)量，又能促進(jìn)黃體發(fā)育，進(jìn)而改善了情期受胎率，但對(duì)在GnRH1 缺乏功能性黃體的奶牛來說這種影響受到限制[9-10]。第1 次注射GnRH 的排卵反應(yīng)取決于使用GnRH 時(shí)的發(fā)情周期階段，在發(fā)情周期的第5～9 天奶牛排卵率最高，并確保在排卵卵泡發(fā)育期間P4濃度升高[10]。血漿P4水平為0.5 ng/mL 的奶牛被認(rèn)為是“同步的”[11]。注射PG 會(huì)使功能黃體消溶[12]，黃體退化使LH 脈沖頻率增加，優(yōu)勢(shì)卵泡增加其生長(zhǎng)迅速并產(chǎn)生較高濃度的E2，E2對(duì)下丘腦-垂體軸起正反饋?zhàn)饔?，?dǎo)致LH 激增，出現(xiàn)LH 峰，隨后促進(jìn)排卵，形成黃體[13]。Masoumi 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，注射PG 后48 h 血中P4濃度未降至0.5 ng/mL時(shí)，懷孕的可能性將顯著降低。Nowicki 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在GnRH2 處理后P4濃度高（P4>1ng/mL）比P4濃度低（P4<0.5ng/mL）的奶牛妊娠率低，妊娠損失高。正常生理狀態(tài)下，母牛外周血漿中P4含量在發(fā)情時(shí)最低（<1 ng/mL），E2含量最高（15～25 Pg/mL）[16-18]。定時(shí)輸精在GnRH2 處理后16～18 h 進(jìn)行，排卵發(fā)生在GnRH2 處理后24 h 內(nèi)[11]。本實(shí)驗(yàn)中，布舍瑞林組在第2 次注射后0 h，即PG 注射后48 h，E2達(dá)到最高濃度，P4達(dá)到最低，而生理鹽水組和GnRH 組分別延遲24 h/4 h 和10 h/4 h（E2/P4）；3 組血中P4濃度均低于0.5 ng/mL，生理鹽水組在24 h 時(shí)的E2濃度顯著高于GnRH 組和布舍瑞林組，其他2 組差異不顯著。本研究表明，布舍瑞林第二次注射后0 h，P4和E2濃度的關(guān)聯(lián)性變化，與正常生理狀態(tài)下母牛發(fā)情時(shí)兩激素濃度的關(guān)聯(lián)性變化比GnRH 更一致，生理鹽水組母牛的排卵時(shí)間可能遲于其他2 組。本研究布舍瑞林組LH 峰值比GnRH 組提前2 h 出現(xiàn)，是否2 組奶牛的發(fā)情時(shí)間有所不同，有待進(jìn)一步研究。

Bamber 等[19]研究顯示，初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)牛產(chǎn)后50～65 d 無排卵發(fā)生率分別為29.6%和19.1%。本研究中，在產(chǎn)后（53±3）d，10 μg 和20 μg 布舍瑞林組及GnRH 組的奶牛無排卵發(fā)生率分別是14.3%、27.3%和6.7%。Pursley 等[20]用Ovsynch 程序在奶牛場(chǎng)獲得的受胎率（P/AI）與觀察發(fā)情后人工授精的受胎率相似（39% vs 37%）；Poock 等[2]的研究中采用Ovsynch 方案，母牛產(chǎn)后首次授精受胎率為38.8%，夏季授精的母牛受胎率低于冬季授精的母牛。Ricci 等[4]研究表明，實(shí)施Ovsynch 方案后的荷斯坦母牛受胎率在19.8%～33.0%。在基于Ovsynch 的程序中，GnRH 產(chǎn)品對(duì)首配奶牛的受胎率沒有影響[2]。本研究中，在檢測(cè)卵泡和不檢測(cè)直接輸精的情況下，20 μg 布舍瑞林組的受胎率略高于GnRH 組。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)條件下，20 μg 布舍瑞林可安全、有效地用于奶牛同期發(fā)情-定時(shí)輸精程序。