小尾寒羊S100A1 基因編碼區(qū)外顯子克隆及表達(dá)分析

肖 成，薛佳佳,2，王 晶,3，柳儉強(qiáng)，于永生，張立春，馬惠海，金海國*，曹 陽*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林公主嶺 136100；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長春 130000；3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000）

小尾寒羊是我國地方品種，具有高繁殖力、耐寒、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，但其肉質(zhì)不如國外其他肉羊品種[1]。隨著人們生活水平的提高，高品質(zhì)羊肉越來越受消費(fèi)者歡迎，因此提高小尾寒羊肉品質(zhì)以及選育高品質(zhì)肉羊品種是目前需要解決的一大難題。肌內(nèi)脂肪含量與肉色、肉嫩度及品質(zhì)密切相關(guān)，提高其肌內(nèi)脂肪含量能夠顯著提升肉質(zhì)。肌內(nèi)脂肪含量增加是新的脂肪細(xì)胞產(chǎn)生以及已有脂肪細(xì)胞增殖肥大的過程。新脂肪細(xì)胞形成及成熟需要經(jīng)歷細(xì)胞增殖和分化2 個(gè)階段，期間大量基因、激素、轉(zhuǎn)錄因子等參與調(diào)控[2]。因此，遺傳因素是影響肌內(nèi)脂肪含量形成及脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素，尋找參與小尾寒羊脂肪形成的新候選基因成為關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)室前期通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊前體脂肪細(xì)胞發(fā)育為成熟脂肪細(xì)胞過程中，存在大量的差異表達(dá)基因，其中S100 鈣結(jié)合蛋白A1（S100 Calcium Binding Protein A1，S100A1）基因存在差異表達(dá)（未發(fā)表），但具體表達(dá)規(guī)律不清楚。S100A1 是一種鈣結(jié)合蛋白，參與心肌收縮、線粒體代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡、血管功能。大量研究證明，S100A1基因主要與肌肉形成、心肌疾病、皮膚病及腫瘤癌癥有關(guān)[3-8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，S100A1基因在小鼠脂肪細(xì)胞分化過程中差異表達(dá)[9]。但S100A1基因在其他物種與脂肪相關(guān)的研究仍不豐富。由于實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，S100A1基因可能與脂肪代謝有關(guān)（測(cè)序數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此具有一定的研究價(jià)值。本文以小尾寒羊?yàn)閯?dòng)物樣本，首先檢測(cè)S100A1基因在不同日齡小尾寒羊脂肪組織中的表達(dá)差異，同時(shí)探索了S100A1基因在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)規(guī)律，之后從分子層面研究其基因結(jié)構(gòu)以及突變位點(diǎn)并與實(shí)際生產(chǎn)性狀做關(guān)聯(lián)分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為來自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)研究所飼養(yǎng)的3 日齡和2 月齡小尾寒羊各1 只，6 月齡小尾寒羊63 只。3 日齡小尾寒羊用于提取脂肪組織RNA，6 月齡小尾寒羊3 只，用于提取各組織總RNA。60 只6 月齡小尾寒羊血液用于基因組提取。2 月齡小尾寒羊用來分離前體脂肪細(xì)胞。

1.2 主要試劑 血液基因組試劑盒來自AXYGEN 生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿來自corning 公司；PBS 緩沖液、胰蛋白酶、膠原酶、胰島素、地塞米松等均來自Sigma 公司；TRIZOL 來自Invitrogen 公司；PCR 預(yù)混酶來自康為世紀(jì)生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 Maker 購自TaKaRa 生物有限公司；PCR 引物及測(cè)序服務(wù)由蘇州金唯智生物科技有限公司提供；LightCycler 480 SYBR Green I Master 由羅氏（中國）公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分離小尾寒羊前體脂肪細(xì)胞并誘導(dǎo) 人道處死2 月齡小尾寒羊，無菌取腹股溝處白色脂肪組織，將組織剪成1 mm3方塊。膠原酶II 消化組織，經(jīng)200 目及400 目濾網(wǎng)，過濾出未消化的組織及雜細(xì)胞。1 500 r/min 離心15 min，去除上清液，完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并接種到35 mm 培養(yǎng)皿中，6 h 細(xì)胞貼壁，12 h 換液，除掉雜細(xì)胞及死細(xì)胞的影響。每48 h 換液，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿，胰酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。第4 代細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，胰島素、地塞米松以及IBMX 混合培養(yǎng)液作為誘導(dǎo)I 液誘導(dǎo)細(xì)胞，48 h 換誘導(dǎo)II 液（含胰島素的完全培養(yǎng)基），48 h 后換完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)直到顯微鏡下看到細(xì)胞出現(xiàn)脂滴，油紅O 染色驗(yàn)證成熟的脂肪細(xì)胞。

1.3.2 提取小尾寒羊血液DNA 及各組織總RNA 取250μL 羊血進(jìn)行基因組提取，操作按照AXYGEN 血液基因組提取試劑盒的說明書進(jìn)行。人道處死6 月齡小尾寒羊3 只，無菌取下肌肉、脂肪、肺、脾、腸、心、肝組織。處死3 日齡小尾寒羊1 只，無菌取其腹部皮下脂肪組織，冷凍于液氮中。取黃豆粒大小組織進(jìn)行液氮研磨，研磨后組織粉末用TRIZOL 處理，根據(jù)說明書，提取各組織總RNA。RNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)合格后，根據(jù)TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄酶說明書體外合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL：5×PrimeScript RT Μaster Μix 2 μL、Total RNA 500 ng，RNase Free ddH2O 補(bǔ)充至10 μL。反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。將cDNA 用雙蒸水稀釋10 倍，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)、PCR 產(chǎn)物測(cè)序 根據(jù)Genbank 中預(yù)測(cè)的綿羊S100A1基因組及mRNA 序列（NC_040252.1；XM_00 4002529.3）、內(nèi)參基因GAPDH序列（NM_001190390.1），利用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)得到S100A1基因CDS 區(qū)引物以及各外顯子引物、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列（表1）。

表1 S100A1 基因引物序列

1.3.4 引物特異性驗(yàn)證 引物退火溫度與延伸時(shí)間見表1。擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：預(yù)混酶10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模 板1 μL、ddH2O 8 μL；擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸（延伸時(shí)間見表1），35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min，4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，條帶單一的PCR 引物可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 連接載體及測(cè)序 將S100A1-CDS 以及基因的5個(gè)外顯子PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接體系為10 μL：T 載體1 μL、膠回收產(chǎn)物為0.1～0.3 pmol、補(bǔ)充到10 μL；4℃過夜。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42℃水浴90 s，冰浴5 min，37℃搖床搖1 h，以激活感受態(tài)細(xì)胞。取菌液100 μL 均勻涂到固體培養(yǎng)皿中，正面朝上放置在37℃培養(yǎng)箱30 min，然后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，正面朝下繼續(xù)培養(yǎng)16 h。挑克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃搖床搖4 h 后進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，條帶單一明亮的菌液進(jìn)行測(cè)序。

1.3.6 生物信息學(xué)分析S100A1基因結(jié)構(gòu) 小尾寒羊S100A1基因CDS 區(qū)及外顯子測(cè)序結(jié)果與網(wǎng)上預(yù)測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)。ExPASy 網(wǎng)站中ProParam 程序分析S100A1蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)、理化特性；PROTEAN 軟件預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；Phyre 2 程序預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；Signal IP 預(yù)測(cè)信號(hào)肽；PSORT II 進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)小尾寒羊S100A1基因各組織表達(dá)譜，細(xì)胞各時(shí)期表達(dá)規(guī)律。qRT-PCR 體系為20 μL：Light Cycler 480 SYBR Green ⅠMaster（2×）10 μL、ddH2O 8 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)程序：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃20 s共40 個(gè)循環(huán)，95℃ 5 s，65℃ 1 min，40℃ 10 s，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。Roche Lightcycler 480 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 軟件作圖，利用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析，顯著性水平定為P<0.05，極顯著水平定為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 小尾寒羊S100A1基因各組織RNA 表達(dá)譜 小尾寒羊各組織總RNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖1 所示，S100A1基因在心臟中表達(dá)量最高，其次是肺、腸、脾、腎、肝、肌肉、脂肪；6 月齡脂肪S100A1基因表達(dá)量顯著高于3 日齡。

2.2 小尾寒羊前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)與分化 小尾寒羊前體脂肪細(xì)胞貼壁之前為球狀，6 h 后細(xì)胞開始貼壁，呈不規(guī)則梭型。6 孔板培養(yǎng)細(xì)胞在第5 天細(xì)胞長滿，可以進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，分化后細(xì)胞體積膨大，內(nèi)部出現(xiàn)脂滴。油紅O 染色鑒定成熟脂肪細(xì)胞，脂滴能夠被染成紅色，如圖2 所示。

圖1 小尾寒羊各組織S100A1 基因及不同日齡相對(duì)表達(dá)量

圖2 小尾寒羊成熟脂肪細(xì)胞油紅O 染色圖

2.3 小尾寒羊S100A1基因在細(xì)胞分化期間的表達(dá)規(guī)律在小尾寒羊脂肪細(xì)胞分化過程中，分別于第0、2、4、6、8、10、12 天提取總RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析發(fā)現(xiàn)，S100A1基因在細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)顯著升高，加入體外誘導(dǎo)劑，基因出現(xiàn)顯著降低，最后隨著細(xì)胞分化的開始，S100A1基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高，并保持一定水平（圖3）。

圖3 小尾寒羊細(xì)胞分化過程S100A1 基因相對(duì)表達(dá)量

2.4 小尾寒羊S100A1基因編碼區(qū)及外顯子區(qū)克隆以及生物信息學(xué)分析 以小尾寒羊肝臟組織cDNA 為模板，克隆出S100A1基因的編碼區(qū)，測(cè)序結(jié)果見圖4。小尾寒羊S100A1基因與NCBI 網(wǎng)站上預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，沒有出現(xiàn)突變。通過混池PCR 以及sanger 測(cè)序，成功克隆S100A1基因5 個(gè)外顯子，將測(cè)序序列與網(wǎng)站公布序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，5 個(gè)外顯子均不存在SNP 突變。編碼區(qū)序列經(jīng)生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，S100A1基因CDS 區(qū)具有285 bp 的開放閱讀框，編碼94 個(gè)氨基酸。S100A1 蛋白分子量為10.52 ku；理論等電點(diǎn)4.39，為酸性蛋白；穩(wěn)定系數(shù)8.96，為穩(wěn)定蛋白；平均親水性-0.38，為親水蛋白；S100A1 蛋白氨基酸組成見表2。信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，蛋白為非分泌蛋白；S100A1 蛋白表達(dá)預(yù)測(cè)主要定位在細(xì)胞質(zhì)52.2%、細(xì)胞核17.4%、線粒體13%、高爾基體4.3%、空泡4.3%；S100A1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)存在4 個(gè)α-螺旋、2 個(gè)β-折疊、6 個(gè)轉(zhuǎn)角、2 個(gè)卷曲（圖2）；蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致，基本結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜，但會(huì)形成復(fù)雜的三維空間結(jié)構(gòu)（圖6），其蛋白功能主要由二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)空間結(jié)構(gòu)決定。

3 討 論

圖4 小尾寒羊S100A1 基因CDS 區(qū)序列比對(duì)圖

表2 小尾寒羊S100A1 蛋白氨基酸組成

圖5 小尾寒羊S100A1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖6 小尾寒羊S100A1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

S100 蛋白家族具有一定的保守性，家族成員結(jié)構(gòu)類似、分子量為10～12 ku[10]。它具有細(xì)胞和組織的表達(dá)特異性，同時(shí)具有多種生理功能[11]。S100A1 是S100 蛋白家族成員之一，它能夠與鈣離子結(jié)合，參與機(jī)體多種生理功能。目前有關(guān)S100A1基因與脂肪相關(guān)的研究很少，所以本文探索了S100A1基因在羊脂肪代謝過程中的表達(dá)規(guī)律，并尋找基因突變位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明，S100A1基因在小尾寒羊心臟組織的表達(dá)量最高。S100A1基因具有結(jié)合鈣離子、調(diào)節(jié)心肌收縮的功能，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明了這一點(diǎn)，同時(shí)也間接增加了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度。相比于其他組織，S100A1基因在脂肪組織的相對(duì)表達(dá)量較少，但S100A1基因的表達(dá)量隨著羊日齡的增加以及脂肪組織中新細(xì)胞增生肥大而出現(xiàn)顯著升高。這說明S100A1基因雖然不在脂肪組織中大量表達(dá)，但S100A1基因參與了動(dòng)物脂肪發(fā)育過程。同時(shí)S100A1基因在綿羊脂肪細(xì)胞分化過程出現(xiàn)顯著變化，更加表明S100A1基因參與綿羊脂肪代謝過程。

為深入了解S100A1基因功能，研究探索了S100A1基因的結(jié)構(gòu)。由于NCBI 網(wǎng)站公布的綿羊S100A1基因?yàn)轭A(yù)測(cè)序列，所以本實(shí)驗(yàn)克隆了小尾寒羊S100A1基因的實(shí)際序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)際序列與預(yù)測(cè)序列一致，不存在突變，這說明S100A1基因序列相對(duì)保守。S100A1蛋白分子式C464H722N116O154S4，為酸性蛋白，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，由于編碼序列少，所以蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜。在檢測(cè)基因組突變位點(diǎn)方面，可能由于測(cè)序樣本有限，S100A1基因5 個(gè)外顯子不存在SNP 位點(diǎn)，隨著樣本數(shù)增加，有可能檢測(cè)到存在的SNP 位點(diǎn)。同時(shí)，SNP 位點(diǎn)也可能出現(xiàn)在內(nèi)含子上，進(jìn)而影響其發(fā)揮作用。雖然實(shí)驗(yàn)沒有檢測(cè)到S100A1基因外顯子存在突變位點(diǎn)，但其他結(jié)果表明S100A1基因參與小尾寒羊脂肪細(xì)胞形成與發(fā)育。S100A1基因在脂肪細(xì)胞中發(fā)育的具體功能值得進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

S100A1基因CDS 序列285 bp，編碼94 個(gè)氨基酸，分子量為10.52 ku，為酸性親水穩(wěn)定蛋白，主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了小尾寒羊S100A1基因在不同細(xì)胞分化階段及不同日齡脂肪組織差異表達(dá)。雖然小尾寒羊S100A1基因CDS 序列以及外顯子不存在突變，但仍然值得深入研究其在脂肪代謝上的功能。