硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)對(duì)急性脊髓損傷大鼠的療效

施玉博，余 鈴，郭衛(wèi)春

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院脊柱外科，湖北武漢430060）

急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）是一種由交通事故、高空墜落、運(yùn)動(dòng)損傷等原因所致脊髓受壓，在脊髓損傷平面以下出現(xiàn)感覺、運(yùn)動(dòng)功能障礙、膀胱直腸括約肌功能喪失以及肌張力異常等臨床癥狀［1，2］。根據(jù)損傷機(jī)制不同，脊髓損傷可分為原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷［3，4］。原發(fā)性脊髓損傷主要由機(jī)械性損傷導(dǎo)致，繼發(fā)性脊髓損傷是指脊髓損傷后出現(xiàn)廣泛性水腫，由于受到骨性結(jié)構(gòu)的限制以及硬脊膜的壓迫，脊髓內(nèi)水腫加重，導(dǎo)致脊髓微循環(huán)障礙、血栓形成、血管痙攣和組織缺氧，引起脊髓缺血，出血以及壞死［5，6］。因此，減輕繼發(fā)性脊髓損傷的程度是治療的關(guān)鍵。

目前，臨床上常采用硬膜外減壓的手術(shù)方式治療急性脊髓損傷［7，8］。但是，由于硬膜為堅(jiān)韌無彈性的組織，在硬膜外減壓后，硬膜組織仍會(huì)對(duì)腫脹的脊髓產(chǎn)生壓迫，從而導(dǎo)致脊髓出現(xiàn)缺血、壞死等繼發(fā)性損傷［9］。以往研究發(fā)現(xiàn)，由于硬脊膜切開術(shù)破壞了硬脊膜的完整性，因此不利于脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)［10，11］。硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)通過將硬脊膜補(bǔ)片覆蓋在脊髓損傷部位，一方面能夠?yàn)槟[脹脊髓提供膨出的空間，另一方面維持了硬脊膜的完整性，因而更加有利于脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。因此，本研究通過建立脊髓損傷模型，對(duì)脊髓損傷的大鼠進(jìn)行硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)，觀察硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)對(duì)大鼠急性脊髓損傷的療效，初步探討硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)治療脊髓損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成 年SD 大 鼠42 只，雄 性，8～12 周 齡，體 重280～300g。檢驗(yàn)合格證編號(hào)NO.43004700061116，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2019-004。動(dòng)物購入后先進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，為期1 周，保持環(huán)境安靜整潔，通風(fēng)良好，溫度22～25 ℃。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)的同意和批準(zhǔn)，動(dòng)物福利審查編號(hào)第2019027 號(hào)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及儀器

瑞沃德脊髓損傷儀（瑞沃德生命科技有限公司，型號(hào)：68097），輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（上海涵飛科技公司，型號(hào)：KD-2268），HE 和LFB 染色試劑盒（武漢賽維爾科技公司，貨號(hào)：G1005，G1103），兔源GFAP‐抗（濃度1∶800，武漢賽維爾科技公司，貨號(hào)：GB11096），羊抗兔二抗（濃度1∶300，武漢賽維爾科技公司，貨號(hào)：GB12096）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及硬脊膜制備 選取成年SD 大鼠42 只，按隨機(jī)數(shù)表法分為脊髓損傷組（對(duì)照組）、硬脊膜切開組和硬脊膜擴(kuò)大成形組，每組各12 只，剩余6 只用于制備硬脊膜。6 只健康成年大鼠行腹腔注射10%水合氯醛溶液（350 mg/kg）進(jìn)行麻醉，麻醉處死后，從大鼠脊髓組織表面剝離硬脊膜，并將硬脊膜修剪成約為1.2 cm×1.2 cm 大小。將該新鮮硬脊膜膜置于培養(yǎng)皿中，室溫儲(chǔ)存于Hanks 平衡鹽溶液中，保持適當(dāng)?shù)谋砻嫒∠颉?/p>

1.3.2 脊髓損傷模型及手術(shù)過程 所有大鼠采用10%水合氯醛溶液（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后將大鼠以俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，胸背部脫毛，酒精消毒，常規(guī)消毒鋪巾，以T10棘突為中心，沿脊柱方向作后正中切口，長度約3.0 cm。逐層切開皮膚和皮下組織，鈍性分離椎旁肌肉并充分止血，再次確定并暴露T9～T11棘突，用椎板咬骨鉗咬除T9下椎板及T10全部椎板，暴露硬脊膜。本研究采用Allen 法［12］建立脊髓損傷模型。將大鼠固定在瑞沃德脊髓損傷儀底座上，以T10脊髓背側(cè)血管為中心點(diǎn)，將套管下端墊片與中心點(diǎn)緊密貼附，重量為60 g 的砝碼自30 cm 高處順著套管垂直下落，形成全脊髓損傷模型。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：大鼠雙下肢出現(xiàn)不同程度抽搐，尾巴開始甩動(dòng)，隨后出現(xiàn)遲緩性癱瘓。根據(jù)分組，脊髓損傷組在脊髓損傷造模成功后，逐層縫合肌肉筋膜及皮膚；硬脊膜切開組在脊髓損傷造模成功后，逐層縫合肌肉筋膜及皮膚并在飼養(yǎng)籠恢復(fù)6 h，隨后大鼠再次麻醉成功后，充分暴露損傷部位，剪開脊髓損傷部位硬膜（約1.0 cm），暴露脊髓，并清除硬膜內(nèi)殘留的出血和血凝塊，硬膜不縫合，徹底止血后逐層縫合肌肉筋膜及皮膚；硬脊膜擴(kuò)大成形組重復(fù)硬脊膜切開組之前的實(shí)驗(yàn)步驟，與之不同的是，前者在硬膜切開后，將同種異體硬脊膜以正確的表面取向覆蓋在硬脊膜切除部位的邊緣，用7-0帶線縫合針仔細(xì)縫合，確保移植物和宿主硬脊膜之間緊密相連，徹底止血后逐層縫合肌肉筋膜及皮膚。術(shù)后給予腹腔注射青霉素鉀20 000 IU 以預(yù)防傷口及尿路感染，每天1次，持續(xù)3 d。大鼠定時(shí)進(jìn)行人工膀胱區(qū)按摩排尿，每天3次，直至大鼠可自主排尿即止。保持籠內(nèi)衛(wèi)生整潔，勤換墊料，保持干燥。

1.4 觀察指標(biāo)

大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分完成后，以10%水合氯醛溶液（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后處死大鼠，再次暴露脊髓損傷部位，剪斷神經(jīng)根，取出脊髓損傷處及周邊正常的組織，多聚甲醛常溫固定24 h，經(jīng)石蠟包埋后切片（約4 μm），然后進(jìn)行各類組織病理染色。

1.4.1 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評(píng)分對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)［13］。BBB 評(píng)分是指將大鼠放入透明玻璃箱中，輕敲箱壁，觀察大鼠臀、膝、踝關(guān)節(jié)行走，軀干運(yùn)動(dòng)及其協(xié)調(diào)情況。所有大鼠術(shù)前3 d 進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，依次記錄大鼠術(shù)后1、3、7、14、21、28 d 的評(píng)分。數(shù)據(jù)記錄由兩名對(duì)實(shí)驗(yàn)分組未知的人員共同完成。

1.4.2 脊髓組織蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 切片二甲苯脫蠟后水化，根據(jù)蘇木精-伊紅染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，脫水透明后封片。用顯微鏡對(duì)HE 切片進(jìn)行連續(xù)拍照，描繪出脊髓損傷區(qū)域邊界，利用Image J 軟件進(jìn)行三維重建，計(jì)算脊髓損傷空洞體積。

1.4.3 脊髓組織勞克堅(jiān)牢藍(lán)（luxol fast blue，LFB）染色 切片脫蠟后水化，0.1% LFB 溶液密封浸染8～16 h，酒精分色直至清晰顯示白質(zhì)、灰質(zhì)界限為止，焦油紫溶液復(fù)染后，脫色透明封片。以脊髓損傷為中點(diǎn)，計(jì)算4 mm（頭尾兩端各2 mm）長度的脊髓LFB 染色的積分光密度（integrated optical densi‐ty，IOD）值，利用Ipp 6.0 軟件計(jì)算髓鞘的IOD 值。

1.4.4 脊髓組織膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）染色 切片脫蠟后入水，采用檸檬酸抗原修復(fù)液高壓修復(fù)抗原，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后滴加一抗，4 ℃冰箱過夜，滴加二抗，37 ℃孵育40 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記酶卵白素，加入DAB 顯色，蘇木紫復(fù)染，酒精分色后自來水沖洗10 min，梯度酒精脫水后透明封片。GFAP 陽性（+）細(xì)胞計(jì)數(shù)采用顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算，每張切片選取4 個(gè)不同的視野（放大倍數(shù)400 倍）進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)視野GFAP+細(xì)胞數(shù)量后取均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD 統(tǒng)計(jì)方法，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量的方法分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般情況

所有動(dòng)物造模成功，本次實(shí)驗(yàn)共有3 只大鼠死亡，其中脊髓損傷組、硬脊膜切開組和硬脊膜擴(kuò)大成形組各有1 只，死亡時(shí)間主要在脊髓損傷后的3 d內(nèi)，死亡原因?yàn)槟蚵犯腥?、傷口失血性休克和拒絕進(jìn)食，每組死亡大鼠均予以補(bǔ)充。

2.2 后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況

整體分析發(fā)現(xiàn)，組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互 作 用 差 異 均 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（F時(shí)間×組間=4.38，P時(shí)間×組間<0.05），提示3 組大鼠BBB 評(píng)分在不同時(shí)間點(diǎn)存在顯著差異。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：硬脊膜擴(kuò)大成形組大鼠的BBB 評(píng)分隨著時(shí)間的進(jìn)展，呈上升趨勢(shì)，脊髓損傷組和硬脊膜切開組大鼠的BBB 評(píng)分隨著時(shí)間的進(jìn)展，上升趨勢(shì)逐漸平緩；組間比較：術(shù)后7 d 和21 d，硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)組大鼠BBB 評(píng)分較脊髓損傷組顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），術(shù)后14 d 和28 d，硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)組大鼠BBB 評(píng)分較硬脊膜切開組顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。硬脊膜切開組大鼠BBB 評(píng)分雖然較脊髓損傷組下降，但在各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠BBB 評(píng)分（n=12，±s）Tab 1 BBB scores of rats in three groups at different time points postoperatively（n=12，±s）

表1 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠BBB 評(píng)分（n=12，±s）Tab 1 BBB scores of rats in three groups at different time points postoperatively（n=12，±s）

組別脊髓損傷組硬脊膜切開組硬脊膜擴(kuò)大成形組術(shù)后1 d 000 FP術(shù)后3 d 1.39±0.51 1.25±0.75 1.42±0.56 0.303 0.740術(shù)后7 d 4.41±0.51 5.02±0.66 5.58±1.16 5.960 0.006術(shù)后14 d 8.16±0.83 7.66±1.82 8.66±0.49 3.200 0.038術(shù)后21 d 8.41±1.08 8.00±1.53 9.34±0.78 4.042 0.027術(shù)后28 d 9.34±0.98 8.75±1.54 10.16±0.83 4.500 0.019

2.3 脊髓HE 染色結(jié)果

HE 染色用于評(píng)估大鼠脊髓空洞體積。各組均有白質(zhì)、灰質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞及空洞形成，脊髓損傷組結(jié)構(gòu)更為疏松。脊髓損傷組、硬脊膜切開組和硬脊膜擴(kuò)大成形組的脊髓損傷空洞體積分別為（39.71±4.08）、（38.05±3.81）、（36.15±4.22）mm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.288，P=0.018）。硬脊膜擴(kuò)大成形組脊髓損傷空洞體積低于脊髓損傷組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.14，P=0.04）。硬脊膜擴(kuò)大成形組與硬脊膜切開組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.14，P=0.262）。見圖1、2。

圖1 脊髓組織HE 染色（×50）Fig 1 H & E staining of spinal cord tissue（×50）

圖2 脊髓損傷空洞體積Fig 2 Lesion volume of spinal cord injury

2.4 脊髓LFB 染色結(jié)果

LFB 染色用于評(píng)估白質(zhì)剩余量，與硬脊膜擴(kuò)大成形相比，脊髓損傷組白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，脫髓鞘明顯。脊髓損傷組、硬脊膜切開組和硬脊膜擴(kuò)大成形組的脊 髓 白 質(zhì)IOD 值 分 別 為（1.46±0.43），（1.86±0.47），（2.62±0.48），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.867，P<0.01）。硬脊膜擴(kuò)大成形組脊髓白質(zhì)IOD 值高于脊髓損傷組和硬脊膜切開組，差異具有統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（t=4.99，P<0.01；t=3.27，P=0.004）。硬脊膜切開組IOD 值較脊髓損傷組輕微增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.72，P=0.1）。見圖3、4。

圖3 脊髓組織LFB 染色（×50）Fig 3 Luxol fast blue（LFB）staining of spinal cord tissue（×50）

圖4 脊髓白質(zhì)IOD 值Fig 4 Integrated optical density（IOD）score of white matter of spinal cord

2.5 脊髓GFAP 染色結(jié)果

GFAP 染色用于評(píng)估星形膠質(zhì)細(xì)胞增生情況，細(xì)胞染色為棕黃色，與硬脊膜擴(kuò)大成形相比，脊髓損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，硬脊膜切開組突觸增多、延長。脊髓損傷組、硬脊膜切開組和硬脊膜擴(kuò)大成形組的GFAP+細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為（20.08±2.53）、（21.16±2.28）、（17.66±2.49）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.446，P=0.004）。硬脊膜擴(kuò)大成形組GFAP+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果低于脊髓損傷組和硬脊膜切開組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.42，P=0.021；t=3.5，P=0.001）。硬脊膜切開組GFAP+細(xì)胞數(shù)目較脊髓損傷組輕微升高，但結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.08，P=0.286）。見圖5、6。

圖5 脊髓組織GFAP 染色（×400）Fig 5 Glial fibrillary acidic protein（GFAP）staining of spinal cord tissue（×400）

圖6 GFAP+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果Fig 6 The number of glial fibrillary acidic protein（GFAP）positive（+）cells of spinal cord

3 討論

急性脊髓損傷機(jī)制包括原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷。原發(fā)性脊髓損傷主要由于脊髓受到重?fù)?、牽拉等物理因素而產(chǎn)生的神經(jīng)元壞死和血管結(jié)構(gòu)的破壞［14，15］。繼發(fā)性脊髓損傷主要包括脊髓的水腫、缺血以及腦脊液壓力的改變等方面［16］。原發(fā)性脊髓損傷通常難以逆轉(zhuǎn)，因此，治療的關(guān)鍵在于降低繼發(fā)性損傷的程度。盡管傳統(tǒng)的硬脊膜外減壓手術(shù)能夠減輕硬膜外壓力、改善脊髓損傷患者的預(yù)后，但由于其無法解除硬脊膜對(duì)脊髓的壓迫，脊髓仍會(huì)進(jìn)一步水腫缺血，引起腦脊液壓力的改變［17，18］。本研究顯示，硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)可以促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，減少脊髓損傷空洞體積，抑制脊髓脫髓鞘變性，減少瘢痕組織形成。

脊髓損傷后，硬脊膜會(huì)對(duì)腫脹脊髓的產(chǎn)生持續(xù)性壓迫，導(dǎo)致脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)壓力增高，引起脊髓微循環(huán)障礙。增高的實(shí)質(zhì)內(nèi)壓力會(huì)限制脊髓內(nèi)微靜脈回流，加劇脊髓內(nèi)缺血缺氧的環(huán)境［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷的大鼠在硬脊膜切開后，脊髓通過硬脊膜切口向外突出形成“疝”樣結(jié)構(gòu)，證實(shí)脊髓損傷后會(huì)導(dǎo)致脊髓實(shí)質(zhì)性水腫。另外，腦脊液壓力的改變也會(huì)對(duì)脊髓水腫和缺血產(chǎn)生影響［20］。脊髓損傷后，腫脹的脊髓會(huì)堵塞硬膜下間隙，阻塞正常的腦脊液的流動(dòng)，造成壓力梯度的改變，從而導(dǎo)致硬膜內(nèi)壓力增高，而硬膜內(nèi)壓力的增高會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致脊髓水腫。Kwon 等［18］利用腦脊液引流的方法治療大鼠脊髓損傷，結(jié)果顯示該術(shù)式能夠降低硬膜內(nèi)壓力，改善腦脊液循環(huán)，促進(jìn)脊髓損傷大鼠功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與脊髓損傷組相比，硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)組能夠顯著改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能和組織學(xué)情況，推測(cè)硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)能夠?yàn)槟[脹的脊髓提供向外膨出的空間，降低硬膜內(nèi)壓力，改善腦脊液壓力梯度，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

既往有研究探討了硬脊膜完整性在脊髓損傷中的作用。Iannotti 等［21］利用硬脊膜撕裂模型觀察脊髓損傷的組織學(xué)反應(yīng)，其結(jié)果顯示，與硬脊膜撕裂組相比，成年大鼠在接受同種異體硬脊膜移植后，脊髓損傷囊性空洞面積減小，脊髓損傷部位巨噬細(xì)胞浸潤減少，并改善了腦脊液循環(huán)情況，推測(cè)硬脊膜的完整性能夠維持正常腦脊液的生理狀態(tài)，并防止硬膜外生長抑制因子和炎癥因子對(duì)神經(jīng)再生的影響。在另外一項(xiàng)脊髓鉗夾損傷模型中，Zhang 等［22］發(fā)現(xiàn)完整的硬膜能夠抑制硬膜外成纖維細(xì)胞的增殖和瘢痕組織的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)組GFAP+細(xì)胞數(shù)顯著低于硬脊膜切開組，進(jìn)一步證實(shí)硬脊膜完整性對(duì)脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

需要說明的是，本實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性。本研究模型需要在脊髓損傷之前將棘突椎板切除，而臨床上脊髓損傷的患者常伴有椎體骨折移位，會(huì)對(duì)脊髓造成骨性結(jié)構(gòu)的壓迫，因此，該研究中所采用的脊髓損傷造模方式并不能真實(shí)還原臨床上脊髓損傷的情況。另外，本次研究沒有設(shè)立假手術(shù)組（即只打開椎板，不做脊髓損傷造模），關(guān)于單純切除椎板是否會(huì)對(duì)大鼠脊髓造成損傷，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)可以減少脊髓損傷空洞體積、抑制脫髓鞘變性及膠質(zhì)瘢痕的形成，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。盡管本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示硬脊膜擴(kuò)大成形術(shù)能夠減輕繼發(fā)性損傷的程度，改善神經(jīng)功能恢復(fù)，但有待于更深入的基礎(chǔ)研究以及更多的臨床療效證實(shí)其療效。