基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討烏梅丸治療糖尿病腸病的作用機(jī)制

許宗穎，張冬梅，陸瑞敏，張 迪，舒 展，陳 萌

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京

100029）

糖尿病腸?。―E）是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，臨床發(fā)病率約為10%～20%［1］。其臨床表現(xiàn)為間歇性水樣瀉或脂肪瀉，有時(shí)便秘和腹瀉交替出現(xiàn)，或可表現(xiàn)為頑固性水樣瀉［2］，不僅影響患者生活質(zhì)量，也影響藥物的治療效果，造成了巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。研究顯示，DE 的發(fā)生與植物神經(jīng)病變、腸電生理紊亂、小腸通過(guò)時(shí)間延緩、菌群及腸道激素分泌變化失調(diào)有關(guān)［3］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采取保守治療，除控制飲食和糾正血糖以外，應(yīng)用地衣芽孢桿菌活菌顆粒等益生菌制劑糾正腸道菌群紊亂［4］，甲鈷胺緩解神經(jīng)病變［5］。但針對(duì)糖尿病腹瀉患者，僅應(yīng)用藥物存在無(wú)法有效改善胃腸消化道運(yùn)動(dòng)受限、胃腸激素失調(diào)等問(wèn)題。

中醫(yī)學(xué)雖無(wú)DE 之名，但按照臨床表現(xiàn)可將其歸屬于“泄瀉”范疇。烏梅丸（WMW）由烏梅、細(xì)辛、干姜、黃連、附子、當(dāng)歸、蜀椒、桂枝、人參、黃柏十味藥物構(gòu)成，是《傷寒論》主治“久利”常用方。全方具有酸苦辛甘并進(jìn)，寒熱并用，邪正兼顧的特點(diǎn)，臨床治療多疾病導(dǎo)致的慢性腹瀉療效顯著［6，7］，但其治療DE 作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討烏梅丸治療糖尿病腸病的潛在分子機(jī)制，為深入開展烏梅丸治療DE 及其臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 烏梅丸活性成分的篩選

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)［8］（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，以烏梅、細(xì)辛、干姜、黃連、附子、當(dāng)歸、花椒、桂枝、黨參［9］、黃柏為關(guān)鍵詞分別進(jìn)行檢索，篩選烏梅丸中各藥的活性成分。其中，OB 是指藥物經(jīng)口服給藥后被機(jī)體吸收進(jìn)入血液循環(huán)的相對(duì)量和速率；DL反映化合物中的特定功能基團(tuán)與已知藥物的相似性，二者對(duì)中藥化學(xué)成分活性的評(píng)估具有重要意義。

1.2 靶點(diǎn)篩選及藥物‐化合物‐靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使 用PubChem Search 數(shù) 據(jù) 庫(kù)［10］（https：//pub‐chem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）查詢活性成分的Canonical SMILES 字符串（Simplified molecular in‐put line entry specification，SMILES）。采 用Swis‐sTargetPrediction［11］（http：//www. swisstargetpre‐diction.ch/）數(shù)據(jù)庫(kù)間接預(yù)測(cè)化學(xué)成分作用靶點(diǎn)。輸入化學(xué)成分的Canonical SMILES 字符串，將條件設(shè)定為“Homo sapiens”，進(jìn)行靶點(diǎn)對(duì)接。分別按Swis‐sTargetPrediction P≥0.05 進(jìn)行篩選，去除重復(fù)選項(xiàng)，建立烏梅丸潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

將藥物、活性成分、潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2［12］軟件，構(gòu)建烏梅丸‐活性成分‐作用靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行可視化分析處理。運(yùn)用Network Analyzer 工具進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.3 烏梅丸‐DE‐靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以“diabetes enteropathy”（糖尿病腸?。殛P(guān)鍵詞，通 過(guò)Gene Cards 數(shù) 據(jù) 庫(kù)［13］（https：//www.gene‐cards.org/），TTD［14］（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/），DisGeNET 數(shù) 據(jù)庫(kù)［15］（https：//www.disgen‐et.org/）獲得DE 疾病靶點(diǎn)。將烏梅丸的潛在靶點(diǎn)與DE 的靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，運(yùn)用Venny 2.1［16］（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪 制韋恩圖，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建烏梅丸‐DE‐靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.4 烏梅丸治療DE 的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將匹配得到的烏梅丸治療DE 的靶點(diǎn)蛋白以gene symbol 的 形 式 上 傳 到 String 數(shù) 據(jù) 庫(kù)［15］（https：//string‐db.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)‐蛋白質(zhì)的相互作用分析，設(shè)置物種為“Homo sapiens”（人），置信度得分大于等于0.4，獲得最終的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）。

1.5 GO 富集分析和KEGG 富集分析

運(yùn) 用omicshare（http：//www.omicshare.com/tools）對(duì)交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體（GO）生物過(guò)程以及基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路分析，以P‐value≤0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到烏梅丸治療DE 的潛在生物途徑和信號(hào)通路。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

將篩選得到的核心靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，根據(jù)‐CDOCKER ENERGY 對(duì)烏梅丸中活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。從PBD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）中下載蛋白的三維結(jié)構(gòu)，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載對(duì)應(yīng)成分的三維結(jié)構(gòu)，在受體和配體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Discovery Studio 2016 軟件，選擇CDOCKER（CHARMm 力場(chǎng)）進(jìn)行對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 烏梅丸中活性成分的篩選

通過(guò)TCMSP 共獲得烏梅丸活性成分909 個(gè)（不含重復(fù)值），其中40 個(gè)來(lái)自烏梅，192 個(gè)來(lái)自細(xì)辛，148 個(gè)來(lái)自干姜，48 個(gè)來(lái)自黃連，65 個(gè)來(lái)自附子，125 個(gè) 來(lái) 自 當(dāng) 歸，101 個(gè) 來(lái) 自 花 椒，220 個(gè) 來(lái) 自 桂 枝，134 個(gè)來(lái)自黨參，140 個(gè)來(lái)自黃柏。經(jīng)OB≥30%，DL≥0.18 篩選，共篩選出烏梅丸活性成分108 個(gè)（不含重復(fù)值），其中烏梅8 個(gè)，細(xì)辛8 個(gè)，干姜5 個(gè)，黃連14 個(gè)，附子21 個(gè)，當(dāng)歸2 個(gè)，花椒5 個(gè)，桂枝7個(gè)，黨參21 個(gè)，黃柏37 個(gè)。見表1。

表1 烏梅丸活性化合物基本信息Tab 1 Basic information of active compounds of fructus mune

續(xù)表

2.2 烏梅丸‐成分‐靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

運(yùn)用cytoscape 3.7.2 構(gòu)建烏梅丸‐成分‐靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)一共有252 個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括，10 個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)，103 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)，139 個(gè)潛在靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，共784 條邊。網(wǎng)絡(luò)中紫色橢圓形表示藥物，黃色橢圓形表示活性成分，紅色長(zhǎng)方形表示靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)中的每條邊表示代表藥物所含有的活性化合物以及活性化合物與靶點(diǎn)基因之間的相互作用關(guān)系。節(jié)點(diǎn)的度值表示在網(wǎng)絡(luò)中該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)目，借 助Cytoscape 3.7.2 軟 件 中 的“Network ana‐lyze”功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?。其中，degree值排名前5 的關(guān)鍵化學(xué)成分為槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、β‐谷甾醇（beta‐sitosterol）、木犀草素（luteolin）、豆甾醇（Stigmasterol），對(duì)應(yīng)的de‐gree 值分別是364、86、42、41、25。Degree 值排名前5 的靶點(diǎn)有芳香化酶（CYP19A1）、乙酰膽堿酯酶（ACHE）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶1（CDK1）、細(xì)胞色素P450 1B1（CYP1B1）、多重藥耐藥蛋白1（ABCC1），它們的degree 值分別是19、13、11、9、9。 見圖1。

圖1 烏梅丸‐成分‐潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Compound and potential targets network of fructus mune

2.3 烏梅丸‐DE‐靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將139 個(gè)烏梅丸潛在靶點(diǎn)和714 個(gè)DE 靶點(diǎn)取交集，共得到24 個(gè)靶點(diǎn)，見圖2。通過(guò)Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建烏梅丸‐成分‐DE‐靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)共有34 個(gè)節(jié)點(diǎn)，99 條邊。圖中不同顏色和形狀的節(jié)點(diǎn)代表的信息不同，其中藍(lán)色橢圓形節(jié)點(diǎn)代表共有靶點(diǎn)，粉色三角形節(jié)點(diǎn)代表有效成分，綠色菱形代表藥物烏梅丸，紅色八邊形代表疾病DE。最終得到烏梅丸治療DE 的關(guān)鍵化學(xué)成分共8 個(gè)，分別是槲皮素、山奈酚、木犀草素、吳茱萸次堿（rutaecarpin）、氧麥角甾醇（oxyergoster‐ol）、芝麻素（sesamin）、細(xì)辛脂素（asaricin）、11，14‐二十碳二烯酸（11，14‐eicosaenoic acid），degree 值分別是34，16，14，4，2，2，2，2。烏梅丸‐DE 的共同基因靶點(diǎn)排名前十的為MMP9、SYK、ABCB1、ALOX5、CA2、XDH、MCL1、ALK、GPR35、PTGS2。 見表2。

圖2 烏梅丸與DE 的靶點(diǎn)韋恩圖Fig 2 Venn diagram of Wumei Wan and diabetes enter?opathy

圖3 烏梅丸‐成分‐DE‐靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Compound，diabetes enteropathy and targets net?work of Wumei Wan

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

排除一個(gè)游離靶點(diǎn)蛋白，將23 個(gè)匹配靶點(diǎn)在STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)共有23個(gè)節(jié)點(diǎn)，71條邊，其中評(píng)分≥0.97 的互作蛋白為AKT1‐PIK3R1、AKT1‐SRC、ALXO5‐PTGS1、ALXO5‐PTGS2、IGF1R‐PIK3R1 、MMP9‐SRC 、NOS2‐SRC 、PIK3R1‐SRC，見圖4。通過(guò)分子復(fù)合物檢測(cè)算法（MCODE）進(jìn)一步分析PPI結(jié)果，AKT1、MMP9、SRC、PTGS2、PPARG、NOS2、AHR為烏梅丸治療DE的核心蛋白靶點(diǎn)，見圖5。

表2 烏梅丸治療DE 的潛在靶點(diǎn)Fig 2 Protential targets of Wumei Wan treating diabetes enteropathy

圖4 烏梅丸‐DE 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Wumei Wan and diabetes enteropathy PPIs net?work

2.5 烏梅丸治療DE 靶點(diǎn)的GO 和KEGG 分析結(jié)果

圖5 烏梅丸‐DE PPI 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig 5 Wumei Wan and diabetes enteropathy PPI core tar?gets network

GO 富集分析結(jié)果顯示共獲得61 條生物過(guò)程。排名前10 的生物學(xué)過(guò)程包括不飽和脂肪酸代謝過(guò)程（unsaturated fatty acid metabolic pro‐cess）、類花生酸代謝過(guò)程（icosanoid metabolic process）、酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路（enzyme linked receptor protein signaling pathway）、蛋 白 質(zhì)氨基酸磷酸化（protein amino acid phosphoryla‐tion）、細(xì)胞對(duì)胰島素刺激的反應(yīng)（cellular re‐sponse to insulin stimulus）、磷 酸 化（phosphoryla‐tion）、類花生酸合成過(guò)程（icosanoid biosynthetic process）、不飽和脂肪酸生物合成過(guò)程（unsatu‐rated fatty acid biosynthetic process）、跨 膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路（transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway）。 預(yù) 測(cè)烏梅丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸合成代謝過(guò)程和配體受體結(jié)合過(guò)程干預(yù)DE，見圖6。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示烏梅丸治療DE 的通路共有72 條，主要涉及松弛素信號(hào)通路（Relaxin signaling pathway）、表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑抵抗（EGFR tyrosine ki‐nase inhibitor resistance）、C 型 凝 集 素 受 體（CLRs）信 號(hào) 通 路（c‐type lectin receptor signaling pathway）、內(nèi)分泌抵抗（endocrine resistance）、脂肪細(xì)胞脂解調(diào)節(jié)（regulation of lipolysis in adipo‐cyte）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路（VEGF sig‐naling pathway）、血小板活化（platelet activation）、腫瘤通路（pathways in cancer）等，見圖7、8。

圖6 GO 功能分析氣泡圖Fig 6 Bubble diagram of Go Function analysis

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

通過(guò)上述結(jié)果，通過(guò)CDOCKER 模塊將AKT1，MMP‐9，SRC，PTGS2，PPARG，NOS2，AHR 與關(guān)鍵活性成分山奈酚、木犀草素、槲皮素、吳茱萸次堿、11，14‐二十碳二烯酸進(jìn)行分子對(duì)接。將對(duì)接結(jié)果‐CDOCKER ENERGY 進(jìn)行均一化處理，‐CDOCKER ENERGY 值 越 高，說(shuō) 明 分 子 與 蛋白受體對(duì)接越穩(wěn)定，對(duì)接結(jié)果越可靠。結(jié)果顯示槲皮素、山奈酚、木犀草素與AKT1，MMP‐9，SRC，AHR，PTGS2，PPARG，NOS2 具有較好的結(jié)合作用，11，14‐二十碳二烯酸、吳茱萸次堿與MMP9，SRC，PTGS2，PPARG 具有較好的結(jié)合作用。對(duì)接結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果一致，見圖9。

圖7 KEGG 通路分析氣泡圖Fig 7 Bubble diagram of KEGG pathway analysis

圖8 KEGG 通路圖Fig 8 KEGG pathway

圖9 分子對(duì)接結(jié)果Fig 9 Molecular docking results

3 討論

DE 的發(fā)生主要與長(zhǎng)期存在的炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)，糖尿病引起的胃腸壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)，神經(jīng)元數(shù)量結(jié)構(gòu)改變和神經(jīng)內(nèi)分泌肽分泌減少，腸道微血管障礙是引發(fā)DE 的主要因素［17］。陳萌教授認(rèn)為糖尿病中有一類患者為長(zhǎng)期過(guò)食肥甘厚味，積熱內(nèi)蘊(yùn)，化燥傷津，發(fā)為消谷。即《素問(wèn)·奇病論》［18］云“肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴?！毕嗜站茫瑵駸巅諟?，脾胃受損，脾陽(yáng)不足，清濁不分，大腸傳導(dǎo)失司，遂見泄瀉。烏梅丸中烏梅酸澀性平，滋陰養(yǎng)血，兼能斂肺澀腸，黃連、黃柏味苦性寒，是經(jīng)方中常用的清熱燥濕藥，尤其適用于胃腸濕熱所致的惡心、嘔吐、痞滿、瀉利等癥，干姜、附子、桂枝、細(xì)辛、蜀椒味辛性溫?zé)?，散寒止痛，黨參、當(dāng)歸味甘性平微溫，健脾養(yǎng)肝，氣血雙補(bǔ)，十味藥合用，辛散酸收、苦泄甘補(bǔ)，針對(duì)DE 寒熱錯(cuò)雜、虛實(shí)夾雜的病機(jī)尤為適用。研究表明烏梅丸能夠潰瘍性結(jié)腸炎、腹瀉型腸易激綜合征、腸息肉、糖尿病胃輕癱等多種胃腸道疾病，烏梅丸能夠降低糖尿病大鼠IL‐10、TNF‐ɑ 等炎癥因子水平、降低血糖水平，改善胰島素抵抗和調(diào)節(jié)腸道菌群［19，20］。因此，運(yùn)用烏梅丸治療DE 有堅(jiān)實(shí)的理論和臨床實(shí)踐基礎(chǔ)。

通過(guò)分析烏梅丸‐成分‐DE‐靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，方中的關(guān)鍵化合物為山奈酚、木犀草素、槲皮素、氧麥角甾醇、芝麻素、細(xì)辛脂素、吳茱萸次堿、11，14‐二十碳二烯酸等。研究顯示，山奈酚具有抗氧化、抗癌、抗炎等多種治療作用［21］，口服山奈酚能夠降低NOS 和PGE‐2 水平，抑制結(jié)腸黏膜MPO 活性，降低炎癥因子TNF‐α、IL‐1β、IL‐6 和ICAM‐1 過(guò)度分泌，負(fù)調(diào)控TLR4、NF‐κB 和STAT 炎癥信號(hào)通路，進(jìn)而減輕腸道炎癥損傷［22］。木犀草素具有很強(qiáng)的清除自由基的功能，能夠通過(guò)激活Nrf2/ARE 信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用［23］，同時(shí)能抑制結(jié)腸平滑肌運(yùn)動(dòng)和Ca2+電流，具有一定的止瀉作用［24］。槲皮素作為糖尿病營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，一方面能夠抑制腸內(nèi)葡萄糖吸收、刺激胰島素分泌，以及改善外周組織對(duì)葡萄糖的利用［25］，另一方面能夠調(diào)節(jié)Cl?通道和腸道通透性，改善腹瀉狀態(tài)［26］，同時(shí)可通過(guò)抗炎作用改善腸道微血管細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道微血管障礙［27］。氧麥角甾醇能夠通過(guò)Fas/Fasl 和Bcl2/Bax 調(diào)控細(xì)胞凋亡［28］。芝麻素具有良好的神經(jīng)元保護(hù)作用，可以降低血糖水平，改善神經(jīng)元活動(dòng)狀態(tài)，修復(fù)神經(jīng)元損傷和抑制細(xì)胞凋亡［29］；細(xì)辛脂素具有顯著的鎮(zhèn)痛作用［30］；吳茱萸次堿具有強(qiáng)血管活性，可能通過(guò)抑制缺血相關(guān)損傷，維持正常的脂質(zhì)和葡萄糖代謝影響DE［31］。因此，推測(cè)以上關(guān)鍵化合物能夠在烏梅丸治療DE 過(guò)程中發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血糖水平、改善神經(jīng)元活性和腸道微血管障礙的作用。

高血糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是DE 的重要病理?yè)p傷機(jī)制。本課題通過(guò)分析PPI 核心網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，烏梅丸治療DE 的關(guān)鍵靶點(diǎn)為AKT1、MMP9、SRC、PPARG、NOS2、AHR 等。NOS2 是NOS 的一個(gè)亞型，能夠催化大量NO 產(chǎn)生，NO 和過(guò)氧亞硝酸鹽的增加導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的氧化損傷［32］。過(guò)氧物酶體擴(kuò)散者激活受體γ（PPARγ）是核受體家族一員，調(diào)節(jié)多種的信號(hào)包括代謝、炎癥和氧化應(yīng)激通路，腸道內(nèi)PPARγ 的低表達(dá)可能導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，部分炎癥因子如TNF‐α 高表達(dá)能夠抑制PPARγ 表達(dá)［33，34］。MMP9 參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，細(xì)胞外基質(zhì)成分合成與降解的變化在組織修復(fù)和炎癥創(chuàng)口愈合方面起著非常重要的作用，研究表明MMP9 可以通過(guò)血管生成促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變［35］。AHR 是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，其不僅可以作為各種環(huán)境毒素的受體介導(dǎo)毒性反應(yīng)，還可以在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮很重要的功能，AHR 能夠負(fù)向調(diào)控IL‐17 介導(dǎo)的炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生而緩解腸道炎癥［36］。SRC 是一種與膜結(jié)合的非受體酪氨酸激酶，活化的SRC 在細(xì)胞連接處拆卸細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附發(fā)揮重要的作用，研究表明SRC 和腸道粘膜損傷 正 相 關(guān)，SRC 能 促 進(jìn)TNF‐ɑ 刺 激EGF 超 激 活，SRC 過(guò) 表 達(dá) 與 腸 癌 的 進(jìn) 展 有 關(guān)［37］。 AKT1 是mTORC1 的亞基，通過(guò)磷酸化與14‐3‐3 蛋白結(jié)合的方式負(fù)調(diào)控mTOR 活性，在神經(jīng)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)中起作用［38］。烏梅丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)上述關(guān)鍵靶點(diǎn)表達(dá)介導(dǎo)抗炎抗氧化應(yīng)激及神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)而對(duì)DE 產(chǎn)生了一定的治療作用。

利用Omicshare 平臺(tái)對(duì)烏梅丸和DE 的交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析，結(jié)果表明，烏梅丸治療DE的核心通路主要涉及松弛素信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、CLRs 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路等信號(hào)通路。CLRs 作為樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞的模式識(shí)別受體（PRRs），在配體結(jié)合后，CLRs 刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，觸發(fā)對(duì)病原體的先天和適應(yīng)性免疫［39］，研究證實(shí)CLRs 能夠識(shí)別晚期糖基化終末產(chǎn)物［40］，在DE 的腸道微生物黏膜免疫平衡和腸道神經(jīng)血管病變中發(fā)揮關(guān)鍵作用。EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗信號(hào)通路中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與腸壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)可能存在關(guān)聯(lián)。EGFR 是一種參與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶，高血糖可以誘導(dǎo)EGFR 和AKT 磷酸化，增加ROS 水平，最終可能導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)重構(gòu)，包括組織紊亂、細(xì)胞凋亡和纖維化［41］，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病刺激EGFR、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IG‐FR），激活A(yù)KT 導(dǎo)致心臟細(xì)胞重構(gòu)［42］，EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗信號(hào)通路也可能通過(guò)同樣模式引發(fā)胃腸壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)，導(dǎo)致DE 發(fā)生。松弛素信號(hào)通路參與減緩和延遲糖尿病并發(fā)癥。松弛素與胰島素為同源激素超家族，對(duì)心臟、血管和結(jié)締組織內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)有重要的影響。研究發(fā)現(xiàn)外源性松弛素可以改善糖尿病患者胰島素敏感性［43］，促進(jìn)動(dòng)脈和微血管擴(kuò)張，從而增加器官灌注，對(duì)抗缺血性損傷，改善血管的不良重構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的翻轉(zhuǎn)，從而發(fā)揮抗纖維化作用［44］。松弛素信號(hào)通路對(duì)DE 病理改變具有多重作用，在DE 中的作用值得進(jìn)一步研究。VEGF 信號(hào)通路在血管生成和發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要，與腸道微循環(huán)密切相關(guān)。VEGF能夠增加血管通透性，增加血管內(nèi)皮遷移、增殖和血管形成［45］。VEGF 與VEGFR‐2 的結(jié)合導(dǎo)致不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑的級(jí)聯(lián)，如PI3K‐Akt 信號(hào)通路、P38 MARK 信號(hào)通路、Ca2+信號(hào)通路等，并介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)其內(nèi)皮細(xì)胞存活和血管通透性。COX2 間接作用于PGI2，PGI2 具有擴(kuò)血管和抗血小板聚積作用，能夠通過(guò)PPAR/14‐3‐3 途徑保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞存活并減少血管平滑肌細(xì)胞凋亡［46］。綜上，本研究富集到的KEGG 通路與DE 存在一定關(guān)系，烏梅丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道免疫平衡，抑制胃腸壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)，改善腸道微血管障礙等治療DE。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，系統(tǒng)闡述了烏梅丸治療DE 的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)烏梅丸治療DE 的主要成分是山奈酚、木犀草素、槲皮素、氧麥角甾醇、芝麻素、細(xì)辛脂素、吳茱萸次堿等，其核心基因是AKT1，MMP9，SRC，PPARG，NOS2 等，通過(guò)參與不飽和脂肪酸代謝過(guò)程、類花生酸代謝過(guò)程、酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路、蛋白質(zhì)氨基酸磷酸化、細(xì)胞對(duì)胰島素刺激的反應(yīng)等脂肪酸合成代謝過(guò)程和配體受體結(jié)合相關(guān)的生物過(guò)程，通過(guò)松弛素信號(hào)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、CLRs 信號(hào)通路等通路調(diào)節(jié)腸道免疫平衡，抑制胃腸壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)，改善腸道微血管障礙，從而發(fā)揮治療的作用。這為進(jìn)一步研究烏梅丸治療DE 的作用機(jī)制提供了線索和理論依據(jù)，但本研究仍存在諸多局限性，在今后的研究中，可以通過(guò)動(dòng)物模型，從DE 胃腸壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)和腸道微血管障礙角度對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。