巖羊多動(dòng)物鏈球菌分離鑒定及藥酶試驗(yàn)研究

張總超，闞 威，林元清，王云平

（青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海西寧810000）

近年來(lái)，由多動(dòng)物鏈球菌引起動(dòng)物感染后死亡的病例頻頻爆發(fā)，感染多種動(dòng)物，并且傳染性強(qiáng)、病死率高。疫情感染較復(fù)雜，難以有效治愈，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。多動(dòng)物鏈球菌病是主要由鏈球菌屬，多動(dòng)物鏈球菌引起的一種人畜共患病，是一種呈鏈狀排列的革蘭氏陽(yáng)性球菌。1999年，Devriese 等[1]首次從患有乳房炎的奶牛及生殖道和扁桃體、山羊及貓的扁桃體、金絲雀的嗉囊、呼吸道及綿羊和貓的扁桃體中分離出該菌，并得到分類命名。此外，Twomey 等[2]在羊駝與野雞體內(nèi)也分得多動(dòng)物鏈球菌。我國(guó)在2016年首次報(bào)道過(guò)山羊感染多動(dòng)物鏈球菌病的病例，并成功從患羊鼻腔內(nèi)分離得到優(yōu)勢(shì)菌株[3]。2018年，王麗陽(yáng)等[4-5]首次在國(guó)內(nèi)分離出豬源性多動(dòng)物鏈球菌。多動(dòng)物鏈球菌導(dǎo)致人感染的病例屢有報(bào)道，曾從人類硬膜下膿腫液中分離到該細(xì)菌[6]。陸續(xù)多次報(bào)道的多動(dòng)物鏈球菌感染事件，說(shuō)明其危害不亞于鏈球菌屬其他型造成的危害。

近期，在青海省祁連縣境內(nèi)發(fā)現(xiàn)一巖羊出現(xiàn)四肢乏力、行動(dòng)困難、呼吸急促等癥狀，后經(jīng)該縣動(dòng)物疫控中心救治無(wú)果，最終死亡的病例。祁連縣工作人員及時(shí)無(wú)菌采集新鮮病料送至青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，中心工作人員對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌學(xué)診斷。按照描述的臨床癥狀疑似鏈球菌感染，通過(guò)直接觸片、染色鏡檢、分離純化培養(yǎng)等方式進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)該巖羊體內(nèi)（肝、脾、肺）中存在有大量革蘭氏陽(yáng)性鏈狀小球菌。進(jìn)一步分離純化、生化鑒定、16S rRNA測(cè)序，并對(duì)分離株細(xì)菌S1進(jìn)行藥敏試驗(yàn)分析，以期對(duì)多動(dòng)物鏈球菌病的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 待檢材料

送檢已死亡巖羊的臟器（心、肝、脾、肺、腎）作為試驗(yàn)檢測(cè)病料。

1.1.2 試劑和設(shè)備

試劑：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、K-B法藥敏紙片（25種）、細(xì)菌微量生化鑒定管、0.5麥?zhǔn)媳葷峁芫?gòu)自杭州微生物試劑有限公司；DNA 提取試劑盒、2000DNA Marker、PCR 反應(yīng)預(yù)混酶、50×TAE、瓊脂糖均購(gòu)自北京全式金公司。

設(shè)備：顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、PCR 擴(kuò)增儀（Bio-RAD，Mexico）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RAD，USA）；水浴恒溫振蕩器、DYY-12型電腦三恒多用電泳儀與DYCP-31A型電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.1.3 引物合成

參考Muyzer等[7]方法設(shè)計(jì)引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成細(xì)菌鑒定用通用引物16S rRNA 基因引物，引物序列及大小見(jiàn)表1。

表1 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增引物Tab.1 PCR amplification primers for 16S rRNA gene

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料觸片鏡檢檢查

將病死巖羊的病料組織心、肝、肺病理變化部位觸片后進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.2 病原分離培養(yǎng)

將無(wú)菌采集死亡巖羊的心臟、肝臟、肺臟等臟器觸片革蘭氏染色鏡檢，并將病料接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌；取24 h的增菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行純化培養(yǎng)；純化菌落劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、血瓊脂平板，37 ℃、24 h 培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)；隨機(jī)挑選疑似目標(biāo)單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，培養(yǎng)24 h，涂片革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 生化鑒定

鏈球菌屬生化特性鑒定參考《獸醫(yī)微生物》第五版[8]。將血清肉湯24 h 培養(yǎng)物，按照杭州微生物試劑有限公司《鏈球菌屬生化鑒定管說(shuō)明書》，接種于生化反應(yīng)管，觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.2.4 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序

取純化后營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，按照細(xì)菌DNA 提取試劑盒說(shuō)明書，提取細(xì)菌基因組作為PCR反應(yīng)模板。

16S rRNA基因PCR擴(kuò)增：16S rRNA條帶194 bp，PCR擴(kuò)增體系為50μL：PCR預(yù)混酶25μL、上下游引物各1μL、DNA 模板2 μL、雙蒸水21 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃、5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

目的條帶的PCR 產(chǎn)物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，并應(yīng)用MEGA5.1軟件對(duì)16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用Kirby—Bauer 法。挑取單個(gè)菌落接種于MH 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，調(diào)整菌液濃度相當(dāng)于0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬?.0×108CFU/mL）。用移液器移取200 μL，用涂菌棒均勻涂布于M-H瓊脂平板上，等培養(yǎng)基表面干燥后放置藥敏紙片使其緊貼培養(yǎng)基表面，于37 ℃培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑，參照杭州微生物試劑有限公司提供的藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判定分離菌對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病死巖羊臨床觀察結(jié)果

對(duì)1 只已死亡巖羊進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)鼻腔黏膜與眼結(jié)膜潮紅并有黏性分泌物；剖檢后可見(jiàn)胃膨大，充滿多量液體和氣體，腸壁血管充血和管壁透明菲薄、十二指腸擴(kuò)張，腸道漿膜充血、出血、水腫，盲腸氣腫和黏膜充血、出血；肝臟腫大，有小點(diǎn)狀壞死灶，膽囊充盈；肺臟、心臟、腎臟未見(jiàn)異常變化。

2.2 病料鏡檢結(jié)果（見(jiàn)圖1、圖2）

由圖1、圖2可知，病料中均可檢出革蘭氏陽(yáng)性鏈狀球菌，成長(zhǎng)鏈或短鏈狀。

圖1 病料心臟革蘭氏染色Fig.1 Gram staining of diseased heart

圖2 病料肺臟革蘭氏染色Fig.2 Gram staining of diseased lung

2.3 細(xì)菌純化結(jié)果

對(duì)細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上可見(jiàn)菌落較小、邊緣整齊、呈乳白色、不透明。在血瓊脂平板上培養(yǎng)存在溶血現(xiàn)象。油鏡下進(jìn)行鏡檢觀察可見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性鏈狀球菌，成長(zhǎng)鏈或短鏈狀。

2.4 生化鑒定結(jié)果（見(jiàn)表2）

表2 分離株多動(dòng)物鏈球菌生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Statistical table of biochemical identification test results of isolated Streptococcus pluranimalium strain

由表2 可知，本次分離菌株S1 發(fā)酵棉實(shí)糖、海藻糖和山梨醇，而對(duì)酶類（賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶）、乳糖和菊糖未發(fā)酵。

2.5 分離株細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果（見(jiàn)圖3）

由圖3可知，凝膠電泳后，所測(cè)條帶大小為1500 bp左右，和目的片段大小一致。

圖3 分離株細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of 16S rRNA of isolated bacteria

2.6 16S rRNA基因同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（見(jiàn)圖4）

圖4 分離株多動(dòng)物鏈球菌16S rRNA基因同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果Fig.4 Homology and phylogenetic analysis results of 16S rRNA gene ofStreptococcus pluranimalium isolated

由圖4 可知，分離株細(xì)菌的16S rRNA 基因序列在線Blast 分析顯示，S116S rRNA 基因序列與GenBank 上已登錄（AccessionNo：NR114042、MN023013、LC316932、MH329623）的多動(dòng)物鏈球菌的相應(yīng)序列具有高度同源性≥99.0%。根據(jù)16S rRNA 基因序列與上述同源性較高的多動(dòng)物鏈球菌相應(yīng)序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分離株與其同源較高的4 株菌形成1 個(gè)獨(dú)立分支，且（AccessionNo：NR114042、MN023013、LC316932、MH329623）4 株菌處在同一分支，而與分枝AB701574處在不同的分枝，說(shuō)明同源性不高。

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）

由表3可知，分離株對(duì)青霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、氨芐西林、羧芐西林、頭孢氨芐、麥迪霉素、氯霉素、呋喃唑酮、多西環(huán)素、四環(huán)素、頭孢哌酮、苯唑西林、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢拉定、頭孢他啶、哌拉西林、紅霉素、多黏菌素B高度敏感；對(duì)阿米卡星、復(fù)方新諾明、新霉素、呋喃唑酮具有耐藥性。

表3 分離株多動(dòng)物鏈球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab.3 Results of drug susceptibility test of isolated Streptococcus pluranimalium

3 討論

通過(guò)送檢單信息和電話聯(lián)系獲知，該巖羊在祁連縣境內(nèi)，發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)死亡，發(fā)病巖羊在2 歲齡左右。經(jīng)試驗(yàn)分析，根據(jù)巖羊死亡時(shí)的臨床癥狀和剖檢病理變化，結(jié)合培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)、顏色、大小等和染色顯微鏡觀察結(jié)果，并結(jié)合細(xì)菌生化試驗(yàn)和16S rRNA 測(cè)序結(jié)果，分離得一株多動(dòng)物鏈球菌S1。

試驗(yàn)中對(duì)分離株細(xì)菌S1 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)表明：該分離株細(xì)菌對(duì)青霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、氨芐西林、羧芐西林、頭孢氨芐、麥迪霉素、氯霉素、呋喃唑酮、多西環(huán)素、四環(huán)素、頭孢哌酮、苯唑西林、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢拉定、頭孢他啶、哌拉西林、紅霉素、多黏菌素B高度敏感；對(duì)阿米卡星、復(fù)方新諾明、新霉素、呋喃唑酮具有耐藥性。

我國(guó)西北地區(qū)自20 世紀(jì)60年代以來(lái)，就有多起散發(fā)的綿羊感染鏈球菌病的病例[9]。但是，據(jù)文獻(xiàn)記載，青海省部分地區(qū)雖有溶血性鏈球菌的感染[10-11]，但沒(méi)有關(guān)于野生動(dòng)物感染多動(dòng)物鏈球菌的報(bào)道[12]。這起野生巖羊多動(dòng)物鏈球菌感染的病例表明不能忽視細(xì)菌性疾病，要防止交叉放牧?？梢詤⒖既苎枣溓蚓〉姆揽剞k法，通過(guò)注射多價(jià)菌苗預(yù)防，從而消除傳染源,減少疫病發(fā)生[13-14]。發(fā)病后要對(duì)病畜進(jìn)行及時(shí)隔離治療，圈舍及時(shí)用3%的來(lái)蘇水消毒液進(jìn)行徹底消毒處理。帶菌母畜要果斷淘汰,對(duì)病死畜禽進(jìn)行無(wú)害化處理。治療方面，參考除西醫(yī)按照藥物敏感性實(shí)驗(yàn)用運(yùn)抗生素外，還可在飼料中添加50 g大青葉、20 g雙花、30 g 連翹、30 g 蒲公英、30 g 蒼術(shù)（為細(xì)末），1%拌料飼喂[15]。另外，對(duì)于多種家畜能感染本病的特點(diǎn)出發(fā)，防控應(yīng)遵從預(yù)防為主，防治結(jié)合的原則，圈舍要注意適時(shí)通風(fēng)降溫，搞好衛(wèi)生消毒，增加飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，從提升動(dòng)物機(jī)體本身的抵抗力方面加大對(duì)于本病的防控。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，青海省野生動(dòng)物中存在多動(dòng)物鏈球菌的感染；該菌對(duì)該分離株細(xì)菌對(duì)青霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、氨芐西林、羧芐西林、頭孢氨芐、麥迪霉素、氯霉素、呋喃唑酮、多西環(huán)素、四環(huán)素、頭孢哌酮、苯唑西林、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢拉定、頭孢他啶、哌拉西林、紅霉素、多黏菌素B 高度敏感；對(duì)阿米卡星、復(fù)方新諾明、新霉素、呋喃唑酮具有耐藥性。