2 株雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定及S1 基因遺傳分析

施麗薇，高新樂，承 南，董彥鵬

（江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司，江蘇江陰214400）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitis，IB）是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的雞的一種急性高度接觸性傳染病。雞通過吸入病毒或直接接觸污染物而感染，發(fā)病率通常為100%，表現(xiàn)為急性上呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋數(shù)量和質(zhì)量下降、腎炎等癥狀，嚴(yán)重影響?zhàn)B雞業(yè)的發(fā)展[1]。IBV是單股正鏈RNA 病毒，編碼的蛋白主要有S 蛋白（spike glycoprotein）、M蛋白、N蛋白等。其中S蛋白為纖突蛋白，可裂解為S1 和S2 亞基[2]。S1 亞基攜帶受體結(jié)合位點(diǎn)，影響病毒的組織嗜性[3]。S1 是中和性抗體和特異性抗體的主要誘導(dǎo)劑，在保護(hù)性免疫中也發(fā)揮著重要作用[4-5]。此外，S1 是IBV 中最易變異的基因，這種變異可能導(dǎo)致毒株間存在重要的生物學(xué)差異，因此常用該基因序列確定病毒基因型[6]。

IBV病毒基因組在復(fù)制過程中極易發(fā)生基因突變、缺失、插入及重組等，使IBV不斷發(fā)生變異，不同血清型之間交叉保護(hù)性較低[7]。研究顯示，我國(guó)目前流行的主要基因型為QX型，且毒株間重組現(xiàn)象非常普遍，促進(jìn)病毒進(jìn)化及新基因亞群的出現(xiàn)[8]。本研究于2020年6月從疑似發(fā)病雞場(chǎng)的病死雞體內(nèi)分離到2株IBV毒株，對(duì)其S1基因進(jìn)行遺傳分析及核苷酸同源性分析，以了解IBV 遺傳進(jìn)化情況，為IBV的監(jiān)測(cè)與防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來源

樣品采自安徽蚌埠某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的疑似感染傳染性支氣管炎的病死雞。

1.1.2 雞胚及試劑

試驗(yàn)所用SPF雞胚購自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

HiScript Q RT SuperMix for qPCR（R122-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；remix Taq?（TaKaRa Taq?Version 2.0 plus dye）（RR901A）、DL2000 DNA Marker（3427A）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；Z-10 Spin Column Viral Total RNA Extraction Kit（B158667）、Ezup Column Virus DNA Purification Kit（B518267）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 引物合成

傳染性支氣管炎病毒、H9亞型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、馬立克病毒、禽白血病病毒、呼腸孤病毒、減蛋綜合征病毒引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 Sequence of PCR amplification primer

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒分離

采集氣管、心、肝、脾、肺、腎、法氏囊，按1∶5的比例加入滅菌PBS（pH 值7.2），經(jīng)研磨處理，反復(fù)凍融3 次后8000 r/min離心5 min后取上清，經(jīng)0.22 μm無菌濾器過濾除菌。將上述組織上清液經(jīng)絨毛尿囊腔途徑接種10日齡SPF 雞胚，0.2 mL/胚，棄去24 h 內(nèi)死亡雞胚，48～72 h 收取雞胚尿囊液繼續(xù)接胚，盲傳3 代，收集尿囊液，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR鑒定

提取盲傳后第3 代雞胚尿囊液DNA 和RNA，將RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將獲得的DNA 和cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。體系為25 μL：Premix Taq 12.5 μL、模板2 μL、上下游引物各1 μL、添加ddH2O 至總體積為25 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃、5 min；94 ℃、35 s，54 ℃、35 s，72 ℃、50 s，循環(huán)30次；72 ℃、10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切膠回收并送測(cè)。

1.2.3 序列測(cè)定與分析

對(duì)獲得的序列進(jìn)行分析，從GeneBank 中下載IBV 各分支的S1基因序列作為本研究的參考。利用MEGA X軟件通過Clustal W進(jìn)行序列比對(duì)，通過Neighbour-Joining法進(jìn)行進(jìn)化樹繪制；利用MegAlign 對(duì)分離株和各參考株的S1基因進(jìn)行核苷酸同源性分析。

1.2.4 分離毒株EID50的測(cè)定

用滅菌PBS連續(xù)10倍倍比稀釋分離毒株雞胚尿囊液，每個(gè)稀釋度接種5枚10日齡雞胚，置于37 ℃孵化箱培養(yǎng)，棄去24 h 內(nèi)死亡雞胚。144 h 取出雞胚觀察IBV 典型病變，表現(xiàn)為雞胚卷曲，發(fā)育不良，用Reed-Muench 法[9]計(jì)算EID50。

1.2.5 致雞胚矮小化試驗(yàn)

將病毒尿囊液經(jīng)尿囊腔接種5 枚10 日齡SPF 雞胚，0.1 mL/枚，并設(shè)置陰性對(duì)照組。對(duì)照組接種同樣劑量生理鹽水。將雞胚在37 ℃培養(yǎng)144 h，棄去24 h 內(nèi)死亡雞胚，144 h 打開雞胚觀察胚體病變并稱重，經(jīng)GraphPad Prism8計(jì)算體重平均值及差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離與鑒定（見圖1）

由圖1 可知，用不同病毒的特異性引物對(duì)第3 代雞胚尿囊液進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果僅IBV 為陽性，顯示大小約為1700 bp的條帶，其他病毒引物PCR結(jié)果均為陰性，表明雞胚尿囊液中存在IBV。經(jīng)測(cè)序確定毒株序列，共分離到2株IBV，分別命名為AH01/2020和AH02/2020。

圖1 IBV分離株S1基因的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification of S1 gene of IBV

2.2 病毒S1基因的遺傳進(jìn)化分析（見圖2、圖3）

由圖2、圖3可知，將IBV 分離株與GenBank 上的參考毒株S1 基因進(jìn)行序列比對(duì)并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，可知分離株AH01/2020 為L(zhǎng)SC/99I 型，AH02/2020 為QX 型。AH01/2020、AH02/2020 與參考株S1 基因的核苷酸相似性分別為76.7%～97.8%和78.1%～90.9%。2 株分離毒株與常用疫苗株H120、H52、M41、4/91、W93 的同源性普遍偏低，分 別 為 76.7%～78.3%、76.8%～78.1%、76.8%～78.6%、77.6%～79.4%以及77.1%～78.6%，表明使用傳統(tǒng)疫苗免疫并不能完全保護(hù)雞免于病毒感染。

圖2 基于IBV S1基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on IBV S1 gene sequence

圖3 基于IBV S1基因的核苷酸同源性分析Fig.3 Analysis of nucleotide homology based on IBV S1 gene

2.3 病毒對(duì)雞胚的致病力（見圖4、圖5）

由圖4、圖5 可知，根據(jù)胚體病變情況計(jì)算可得AH01/2020 株EID50為106.17/mL，AH02/2020 株EID50為1010.67/mL。將2株IBV分別感染SPF雞胚，144 h后可見胚體蜷縮、出血、發(fā)育不良等，呈卷曲胚胎，符合IBV 致雞胚病變的表現(xiàn)，感染雞胚病變極其明顯，而對(duì)照胚體無肉眼可見病變。與正常雞胚相比，2 株IBV 感染雞胚體重下降均極顯著（P<0.01）。

圖4 IBV毒株致雞胚病變Fig.4 Embryo lesions caused by IBV

圖5 雞胚胚體重量比較Fig.5 Weight compare of embryo

3 討論

傳染性支氣管炎呈世界性分布，可感染所有日齡的雞。感染雞生長(zhǎng)緩慢、死淘率增加，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[10]。該病目前沒有特異性治療方法，主要通過改善飼養(yǎng)管理?xiàng)l件和疫苗接種來預(yù)防。理想的管理方法包括嚴(yán)格隔離、注重生物安全、減小飼養(yǎng)密度、消除冷應(yīng)激、保證良好的通風(fēng)等[11]。疫苗接種包括活疫苗和滅活疫苗[12]，目前我國(guó)主要應(yīng)用H120、H52、M41 等毒株制備弱毒疫苗和活疫苗，以上毒株均屬于Mass型。但I(xiàn)BV突變率高，主要是由于該病毒特有的套氏轉(zhuǎn)錄方式及病毒RNA酶缺乏校正能力，還有自然選擇、免疫壓力等外在因素影響。此外，IBV血清型眾多，交叉保護(hù)能力較差[13]，常與其他病毒、細(xì)菌混合感染雞群[14-16]，且有研究顯示，近年來QX型IBV占據(jù)了優(yōu)勢(shì)流行地位[17-19]，這些因素給疫苗防控帶來了巨大挑戰(zhàn)。

為進(jìn)一步了解我國(guó)IBV毒株的遺傳變異情況，本試驗(yàn)從安徽某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)病死雞中分離到兩株病毒，接種雞胚可產(chǎn)生典型IBV 病變，經(jīng)PCR 鑒定證實(shí)所分離的病毒為IBV。將分離的2株IBV毒株的S1基因與從GenBank下載的參考株進(jìn)行序列比對(duì)，顯示2株病毒分屬于LSC/99Ⅰ型和QX 型，符合近年來QX 型為主要流行基因型的研究結(jié)果，LSC/99I型的流行也需進(jìn)一步進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)應(yīng)關(guān)注不同基因型IBV 混合感染的情況。2 株IBV 與疫苗株S1 基因的核苷酸同源性偏低，可能是由于長(zhǎng)期使用活疫苗形成的免疫選擇壓導(dǎo)致。這種免疫選擇壓易導(dǎo)致野生毒株發(fā)生基因突變、重組等情況，從而產(chǎn)生新型野毒，使傳統(tǒng)疫苗的保護(hù)力下降[20]。因此，盲目使用IBV疫苗可能會(huì)導(dǎo)致新型變異毒株出現(xiàn)，需對(duì)IBV 進(jìn)行持續(xù)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，尤其應(yīng)注意多種基因型IBV 混合感染、共同流行的情況，為IBV防控和新疫苗開發(fā)提供參考。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)病死雞體內(nèi)分離到2 株病毒，經(jīng)雞胚接種、序列比對(duì)和進(jìn)化樹繪制，可知2株病毒均可導(dǎo)致雞胚出現(xiàn)IBV 特征性病變，根據(jù)進(jìn)化樹分析2 株病毒分屬于LSC/99I 和QX 分支，確定本次分離毒株為雞傳染性支氣管炎病毒。