菊苣多糖對(duì)小鼠藥物性肝損傷保護(hù)作用的篩選

王曉杰，吾買(mǎi)爾江·牙合甫，*，阿麗米熱·買(mǎi)買(mǎi)提，韓俊成，楊 莉，夏利寧，賽福丁·阿不拉，卡哈爾·司馬義

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2. 哈密市伊州區(qū)花園鄉(xiāng)衛(wèi)生院，新疆哈密839000）

菊苣（Cichorium intybusL.）屬于菊科菊苣族菊苣屬的多年生植物。菊苣中的化學(xué)成分主要含三萜、倍半萜、香豆素、花色素類(lèi)等有效活性物質(zhì)[1]。菊苣可入藥，具有清熱解毒、消炎利尿、清肝利膽等療效[2]。菊苣主治肝炎、肝衰竭、肝硬化、腎炎、腸炎等疾病[3]。多糖是一種大分子生物活性物質(zhì)，菊苣多糖具有抗疲勞、抗氧化、降血脂、降血糖、抗癌、抗腫瘤等作用。多糖作為菊苣的有效成分之一，其多糖含量也頗高[4-6]。菊苣多糖保肝作用方面的研究已具備眾多數(shù)據(jù)支持，但沒(méi)有發(fā)揮菊苣多糖的最大藥用價(jià)值，導(dǎo)致資源的潛在浪費(fèi)[7]。

對(duì)乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）是一種廣泛使用解熱鎮(zhèn)痛藥物。臨床上普遍用于人、動(dòng)物機(jī)體發(fā)熱、緩解輕中度疼痛病例。APAP過(guò)量使用或不當(dāng)使用會(huì)造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)。24 h內(nèi)劑量超過(guò)4 g，會(huì)引起肝毒性反應(yīng)；使用劑量超過(guò)10～15 g 可迅速引起急性肝衰竭，嚴(yán)重者死亡。我國(guó)APAP 中毒的發(fā)生在近二十年呈上升趨勢(shì)，對(duì)人民的健康造成潛在威脅[8-11]。對(duì)乙酰氨基酚也是獸醫(yī)廣泛使用的解熱鎮(zhèn)痛藥物之一，包括家畜、家禽各種發(fā)熱疾病，如常見(jiàn)的呼吸道、消化道、生殖系統(tǒng)等細(xì)菌、病毒的感染引起體溫升高的現(xiàn)象。但由于部分獸醫(yī)用藥不規(guī)范，超過(guò)安全劑量或?yàn)E用乙酰氨基酚引發(fā)的中毒案例更為常見(jiàn)[10,12-13]。本試驗(yàn)以APAP 誘導(dǎo)的肝損傷小鼠為模型，提取菊苣種子、根、莖及葉子4個(gè)部位多糖篩選清除自由基的能力，檢測(cè)MDA 含量、SOD、GSH、H2O2酶活及HE 染色來(lái)評(píng)價(jià)菊苣多糖對(duì)肝臟保護(hù)作用，并探討作用機(jī)理，進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)菊苣多糖的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菊苣根、莖、葉及種子均購(gòu)自新疆哈密阿薩爾生物科技有限公司，經(jīng)哈密市伊州區(qū)花園鄉(xiāng)衛(wèi)生院卡哈爾·司馬義鑒定為菊苣。

1.2 試劑與儀器

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）、過(guò)氧化氫酶（H2O2酶）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及Bicinchninic Acid（BCA）蛋白試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）及標(biāo)準(zhǔn)品N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine，NAC）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

UV1900 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）、HTX 多功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）。

1.3 菊苣多糖的提取

參照文獻(xiàn)提取菊苣種子、根、莖及葉子多糖；近紅外色譜發(fā)檢測(cè)樣品，使用苯酚-硫酸顯色法測(cè)定菊苣水提物中總多糖含量，紫外分光光度計(jì)在490 nm 處測(cè)定吸光值[2]。

1.4 DPPH清除試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0079 g DPPH于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至100 mL，即濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液，置于4 ℃冰箱避光保存。將菊苣多糖溶液、NAC 溶液配制成不同濃度梯度的待測(cè)樣品液，使用GraphPad軟件計(jì)算IC50值，具體步驟參考文獻(xiàn)記錄[2]。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

模型建立及動(dòng)物分組和處理：昆明系小鼠，雄性、體重（18±25）g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由進(jìn)食和飲水。小鼠隨機(jī)分為7 組，每組12 只小鼠，正常對(duì)照組（NC），模型組（APAP，300 mg/kg），菊苣多糖高劑量組（H+APAP，600 mg/kg），菊苣多糖中劑量組（M+APAP，300 mg/kg），菊苣多糖低劑 量 組（L+APAP，150 mg/kg），水 飛 薊 賓 陽(yáng) 性 組（APAP+S，300 mg/kg） ，菊 苣 多 糖 單 獨(dú) 組（H，600 mg/kg），正常對(duì)照組灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)3 d。末次給藥1 h 后，正常對(duì)照組（NC）和菊苣多糖單獨(dú)組（H）外，其他組建立急性肝損傷模型，腹腔按劑量300 mg/kg 注射APAP[2]。24 h 后處死小鼠，采集血液、肝組織。各組小鼠禁食，自由飲水。

1.6 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.6.1 血清生化

給予APAP 24 h 后，采集血液。血液室溫靜置2 h，3000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃保存。按照試劑盒操作方法測(cè)定ALT與AST活性。

1.6.2 肝臟生化

稱(chēng)取肝組織0.2 g，用組織勻漿機(jī)冰浴勻漿，2000 r/min，4 ℃離心15 min，上清液-20 ℃保存。按照試劑盒操作方法測(cè)定MDA 含量、SOD、GSH、H2O2酶活性和蛋白質(zhì)的含量。

1.6.3 病理組織切片觀察

取中性福爾馬林溶液固定組織，脫水、石蠟包埋、切片和蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)差異顯著性通過(guò)SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，t檢驗(yàn)比較各組間的差異，數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊苣多糖含量測(cè)定（見(jiàn)圖1）

以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得到回歸方程Y=14.47X-0.0159，（R2=0.9990）。

由圖1可知，其濃度在10～50 mg/L的范圍內(nèi)與峰面積具有優(yōu)良的線(xiàn)性關(guān)系。菊苣種子部位總多糖在四者之中含量最高為39%，其次莖（34%）、葉（29%）、根（28%）。

圖1 菊苣總多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of Cichorium intybus L.total polysaccharides

2.2 菊苣四種不同部位所提取多糖的紅外光譜結(jié)果（見(jiàn)圖2）

圖2 菊苣多糖紅外光譜圖Fig.2 IR spectum of Cichorium intybus L.polysaccharide

由圖2 可知，在400～4000 cm-1范圍內(nèi)顯出典型的多糖吸收峰。3379～3383 cm-1處為O—H 的伸縮振動(dòng)[9]；1606～1616 cm-1內(nèi) 的 吸 收 峰 是C=O 伸 縮 振 動(dòng) 峰[10]；2930 cm-1左右的吸收峰為C—H 伸縮振動(dòng)吸收峰；在1000～1200 cm-1內(nèi)的3個(gè)弱吸收峰表示吡喃型糖環(huán)。

2.3 菊苣多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果（見(jiàn)圖3）

圖3 菊苣4個(gè)部位多糖對(duì)DPPH的清除效果Fig.3 DPPH radical scavenging activity of Cichorium intybus L.polysaccharide

由圖3可知，隨著濃度的升高，菊苣多糖清除DPPH自由基的能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度為1 g/L 時(shí)，菊苣種子、葉、根、莖多糖對(duì)DPPH 自由基的最大清除率達(dá)70%、64%、48%、62%，相應(yīng)的IC50值分別為0.2094、0.3713、0.3966、0.3902 mg/mL。其中，種子部位所提取的多糖對(duì)DPPH自由基的清除率最強(qiáng)。

2.4 菊苣種子多糖對(duì)肝功能的影響（見(jiàn)圖4）

圖4 菊苣種子多糖對(duì)肝功能的影響Fig.4 Effect of chicory seed polysaccharide on liver function

由圖4可知，APAP組的ALT、AST活性與NC組相比，差異極顯著（P<0.01），H 組與APAP 組相比差異極顯著（P<0.01），提示模型建立有效。其中，單項(xiàng)分析ALT 結(jié)果顯示，APAP+H 組、APAP+M 組、APAP+L 組與APAP 組相比差異極顯著（P<0.01）。APAP+H 組、APAP+M 組的AST活性與APAP 組相比差異極顯著（P<0.01），APAP+L 組與APAP 組相比差異顯著（P<0.05）。以上結(jié)果提示，菊苣多糖對(duì)APAP藥物性肝損傷具有潛在保護(hù)能力。

2.5 菊苣種子多糖對(duì)過(guò)氧化產(chǎn)物的影響（見(jiàn)圖5）

圖5 菊苣種子多糖對(duì)氧化反應(yīng)產(chǎn)物的影響Fig.5 Effect of chicory seed polysaccharides on oxidation reaction products

由圖5 可知，APAP+H 組、APAP+M 組的肝組織谷胱甘肽活性與APAP 組差異極顯著（P<0.01），APAP+L 組與APAP組差異顯著（P<0.05）；APAP+H組、APAP+M組的超氧化物歧化酶活性與APAP 組差異顯著（P<0.05）；APAP+H組、APAP+M組、APAP+L組的丙二醛含量與APAP組差異極顯著（P<0.01）；APAP+H 組、APAP+M 組、APAP+L 組的過(guò)氧化氫酶活性與APAP組差異極顯著（P<0.01）。安全劑量?jī)?nèi)菊苣多糖可降低APAP引起的MDA和H2O2酶水平的損傷性升高，可改善APAP 引起的對(duì)GSH 和SOD 的消耗，從而起到一定程度的肝臟保護(hù)作用。

2.6 各組肝臟病理切片結(jié)果（見(jiàn)圖6）

圖6 各組肝臟病理切片結(jié)果（×400）Fig.6 The results of hepatic pathology in each group（×400）

由圖6 可知，在400 倍光鏡下觀察，NC 組和H 組中央靜脈為軸心呈放射狀排列，細(xì)胞排列緊密，無(wú)明顯差別。APAP 組發(fā)現(xiàn)中央靜脈周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)并存在出血，胞質(zhì)間空隙增大，伴隨大量空泡樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，表明APAP過(guò)量導(dǎo)致肝組織發(fā)生明顯的病理變化；APAP+M 組、APAP+H 組與APAP 組比較肝損傷明顯減輕，多糖治療組可顯著減緩APAP對(duì)肝細(xì)胞的損害；APAP+LAPAP治療組中可見(jiàn)中央靜脈周?chē)仔约?xì)胞的局部浸潤(rùn)及管腔壁的增厚。因此，菊苣多糖能恢復(fù)APAP引起的肝細(xì)胞破裂、肝組織毒性病理變化，證實(shí)具有明顯的保護(hù)作用。

3 討論

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是藥物代謝引起肝毒性或肝臟對(duì)藥物及代謝產(chǎn)物的變態(tài)反應(yīng)所產(chǎn)生的消化道系統(tǒng)疾病。目前，DILI病例上升速度及嚴(yán)重的危害性引起藥物研究者的重視。由于服用藥物者肝臟代謝功能降低、腎功能減退，導(dǎo)致機(jī)體未及時(shí)代謝產(chǎn)生毒性反應(yīng)。獸藥則對(duì)病畜產(chǎn)生DILI現(xiàn)象更為明顯，加速病畜死亡。因此，如何減緩、治愈甚至預(yù)防DILI 無(wú)疑是一個(gè)迫在眉睫的課題。對(duì)乙酰氨基酚是人、獸醫(yī)臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物[14-15]。該藥物在治療劑量閾值范圍內(nèi)具有良好的安全性，但攝入過(guò)量可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的肝毒性作用，甚至導(dǎo)致危及生命的急性肝衰竭（ALF）。肝臟是機(jī)體內(nèi)代謝藥物的場(chǎng)所，藥物進(jìn)入體內(nèi)后于肝臟處進(jìn)行代謝，用藥過(guò)量或用藥不當(dāng)都會(huì)使肝臟超負(fù)荷工作而引起損傷，藥物代謝后產(chǎn)生的代謝毒性產(chǎn)物甚至?xí)?dǎo)致肝臟的急性衰竭。如過(guò)量使用APAP 即會(huì)導(dǎo)致劑量依賴(lài)性肝損傷，APAP 進(jìn)入機(jī)體后，大部分藥物在肝臟進(jìn)行代謝，包括兩種代謝途徑，即硫酸化和葡萄糖醛酸化偶聯(lián)反應(yīng)及氧化成反應(yīng)中間體N-乙酰對(duì)苯醌亞胺（N-acetyi-p-benzoquinone imine，NAPQI），后者與GSH 反應(yīng)形成無(wú)毒代謝物。其中約65%的藥物參與葡糖醛酸化反應(yīng)，約30%的藥物參與硫酸化反應(yīng)，隨后產(chǎn)生無(wú)毒結(jié)合物隨尿液排出體外[16-17]；剩余約5%的藥物在細(xì)胞色素酶的作用下產(chǎn)生有毒性的中間產(chǎn)物NAPQI，這種APAP毒性代謝反應(yīng)主要是由細(xì)胞色素P450家族2E1（CYP2E1）催化[18]。GSH 與之結(jié)合可產(chǎn)生無(wú)毒產(chǎn)物，從而緩解APAP 的毒性作用，但攝取超治療劑量的APAP會(huì)導(dǎo)致NAPQI的過(guò)量產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的消耗以及NAPQI與細(xì)胞和線(xiàn)粒體蛋白的共價(jià)結(jié)合，從而導(dǎo)致核DNA損傷。線(xiàn)粒體的損傷使組織產(chǎn)生過(guò)氧化反應(yīng)，過(guò)氧化產(chǎn)物MDA和H2O2酶的水平隨著線(xiàn)粒體的損傷程度增加而升高，SOD 作為一種抗氧化酶，則隨著損傷的增加而被消耗[19-21]。本試驗(yàn)測(cè)定GSH、MDA、H2O2酶含量統(tǒng)計(jì)顯示高、中、低劑量組與模型組均表現(xiàn)出一定的差異性，含量統(tǒng)計(jì)顯示高、中劑量組與模型組差異顯著?？赏茰y(cè)安全劑量?jī)?nèi)菊苣多糖可降低APAP引起的MDA和H2O2酶水平的損傷性升高，可改善APAP 引起的對(duì)GSH 和SOD 的消耗，從而起到一定程度的肝臟保護(hù)作用。這與上述文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果一致。ALT和AST是肝臟的代表性轉(zhuǎn)氨酶，肝細(xì)胞受損時(shí)，轉(zhuǎn)氨酶釋放到血液中，使血清谷丙、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性升高。據(jù)報(bào)道，對(duì)嚙齒動(dòng)物采用APAP 過(guò)量誘導(dǎo)的模型普遍被認(rèn)為是一種探索新的治療策略的活體動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)體系，包括對(duì)天然產(chǎn)物的測(cè)試[22]。菊苣多糖能有效防止肝臟細(xì)胞膜的破裂，降低APAP引起的ALT和AST的損傷性升高。本研究選取藥用植物菊苣，建立小鼠DILI模型探究菊苣的肝保護(hù)作用，為進(jìn)一步挖掘菊苣藥用價(jià)值奠定基礎(chǔ)，為深入研究菊苣提供前期依據(jù)。

4 結(jié)論

菊苣種子、葉、根、莖多糖含量依次為39%、34%、29%、28%，自由基清楚率依次為70%、64%、48%、62%，其中種子多糖對(duì)DPPH自由基的清除率最強(qiáng)。菊苣多糖對(duì)APAP引起的藥物性肝損傷具有明顯的修復(fù)和緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，其高劑量多糖則更能發(fā)揮其作用，緩解APAP 造成的氧化產(chǎn)物水平的升高和肝組織病理變化。