腦小血管病性認知障礙與外周血血漿外泌體濃度的相關(guān)性

孫文強,尹昌浩,劉 平,譚 琳,賀夢菲,趙維納,4

(1.牡丹江醫(yī)學院;2.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江 牡丹江 157011;3.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院健康管理科,廣東 廣州 510515;4.黑龍江省缺血性卒中重點實驗室,黑龍江 牡丹江 157011)

隨著我國人口老齡化的進展,血管性認知障礙的發(fā)生發(fā)展得到了廣泛的關(guān)注。腦小血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)是血管性認知障礙的主要原因,CSVD性認知障礙起病隱匿,逐漸發(fā)展成癡呆,占各類型癡呆綜述的45%,給社會和家庭帶來沉重的負擔[1]。外泌體是一種體內(nèi)多種細胞分泌的膜性小囊泡,神經(jīng)元性外泌體可自由穿過血腦屏障,并且穩(wěn)定的存在于血液中[2-3],在血液中檢測可反應腦部的病理改變,因此外泌體在認知障礙的發(fā)生與發(fā)展中具有很大的研究價值。外泌體作為細胞和組織信號傳遞的載體,在介導細胞通訊的過程中承擔著miRNA轉(zhuǎn)移的作用[2]。對于miRNA是否以外泌體作為載體從而介導CSVD性認知障礙的形成,目前尚無報道,且尚無證據(jù)表明差異表達的miRNA的差異量是否與外泌體的濃度有關(guān)。本研究擬通過提取、驗證CSVD性認知障礙患者與健康對照人群的外周血中外泌體并檢測其濃度,比較兩組間的外泌體濃度差異,探討血漿外泌體是否在CSVD性認知障礙患者發(fā)病機制中起作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2019年5月至2020年2月于牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院或門診診斷為CSVD性認知障礙患者30例為觀察組,另選取健康志愿者30例為對照組。觀察組男13例,女17例;年齡53～75歲,平均(63.90±8.33)歲,平均受教育年限(9.80±2.74)年;對照組男15例,女15例,年齡54～68歲,平均(60.67±5.86)歲,平均受教育年限(10.50±1.52)年。兩組高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙、飲酒情況等基礎資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05) 。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準,與患者簽署知情同意書。

1.2 CSVD性認知障礙診斷標準及納排標準

1.2.1 CSVD性認知障礙診斷標準 依據(jù) 2019 年中華醫(yī)學會老年醫(yī)學分會老年神經(jīng)病學組《腦小血管病相關(guān)認知功能障礙中國診療指南》推薦診斷為腦小血管病認知損害的診斷標準：(1)證實存在有認知功能障礙;(2)證實存在有腦小血管病;(3)確定腦小血管病是引起認知功能障礙的主要因素,并除外其他疾病所致的認知功能損害。

1.2.2 CSVD性認知障礙納入和排除標準 納入標準：(1)符合《腦小血管病相關(guān)認知功能障礙中國診療指南》CSVD性認知障礙診斷標準;(2)簡易智力狀態(tài)檢查量表(MMSE)評估總體認知功能,得分小學組<21分,中學組和大學組<24分;蒙特利爾認知量表(MoCA)評分<26分,如果患者受教育年限≤12 年則在測試結(jié)果上加上1 分;(3)患者既往無癡呆病史,臨床癡呆量表(CDR)<1分;(4)患者病情穩(wěn)定。排除標準：(1)3個月內(nèi)有急性腦血管疾病史,Hachiski缺血量表>4分;(2)原有嚴重心臟病者,包括：充血性心力衰竭、不能控制的心律失常等;(3)原有影響血脂代謝的疾病;(4)有重度抑郁,雙向障礙,精神分裂癥等精神疾病病史;(5)顱腦MRI或CT檢查,除外顱腦占位及感染 、正壓性腦水、腦腫瘤、進行性核上性麻痹、硬膜下血腫、帕金森病等。(6)除外造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷的腦外傷及其他腦結(jié)構(gòu)異常等;(7)除外其他可引起認知下降的系統(tǒng)性疾病。

1.3 神經(jīng)心理學評估采用蒙特利爾認知評估量表(MoCA) 評價兩組認知功能,包括注意(3分) 、語言(5分) 、執(zhí)行(3分) 、記憶(6分) 、視結(jié)構(gòu)技能(4分) 、計算力(3分) 和地點定向力(6分) ,評分0～30分,分值越高,患者認知功能越良好。

1.4 外泌體提取及鑒定

1.4.1 血漿的分離 清晨6～8點采集所有受試者空腹靜脈血10 mL,在4 ℃,2500 r離心10 min,取上清液即為血漿,凍存于-80 ℃,以上過程在2 h內(nèi)完成。

1.4.2 血漿外泌體的提取 采用ExoQuick試劑盒法提取血漿外泌體,將血漿樣品轉(zhuǎn)移至離心管中,于4 ℃以3000 g離心10 min,去除樣品中的細胞碎片。去除細胞碎片的上清液轉(zhuǎn)移至新離心管,于4 ℃以10000 g離心20 min,去除樣品中雜質(zhì),將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中。在0.5 mL去除雜質(zhì)的離心上清液中加入2.5 mL BIS試劑,使用渦旋振蕩器震蕩離心管1 min使溶液充分混合,再放置2 ℃～8 ℃ 靜置2 h。取出裝有混合液的離心管于4 ℃以10000 g離心60 min,棄去上清液。取50 μL 1×PBS緩沖液均勻吹打離心沉淀物,待其均勻分布在PBS中,然后轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中。將離心管于4 ℃以12000 g離心2 min,留取上清液凍存于-80 ℃冰箱。

1.4.3 外泌體透射電鏡 從-80 ℃冰箱取出凍存的血漿外泌體,解凍后用1×PBS溶液適當稀釋。使用移液器吸取10 μL稀釋后的外泌體滴至200目銅網(wǎng)上,室溫下處理20 min,將外泌體處理過的銅網(wǎng)轉(zhuǎn)移至20 μL的1×PBS溶液中固定,重復兩次。用4%戊二醛固定20 min,濾紙吸干并用1×PBS洗滌,置于室溫下晾干,于透射電鏡下觀察,80 KV電壓下成像。

1.4.4 外泌體粒徑分析 經(jīng)過Exoquick試劑盒提取得到的外泌體取50 μL加950 μL 1xPBS進行1∶20稀釋,使用0.22 μm 濾膜過濾外泌體稀釋液。過濾后的外泌體懸液直接使用納米粒度顆粒跟蹤分析儀(NanoSight NS 300)進行粒徑檢測,使用軟件NTA3.2Dev Build 3.2.16進行分析。NanoSight NS 300配備sCMOS相機進行拍攝,激光類型為Blue488,快門317,增益15。每個樣本重復3次。

1.4.5 外泌體總蛋白提取 實驗前將裂解液2～8 ℃融化混勻后置于冰上,將外泌體樣本與裂解液按體積比1∶1混勻后置于冰上裂解10 min,于4 ℃以12000 g離心5 min,將上清液裝入離心管中置于-80 ℃冰箱備用。

1.4.6 外泌體濃度測定 計算BCA工作液總體積,定量取溶液A∶溶液B=50∶1,混勻,制成BCA工作液。取一定量的BSA標準溶液,用1×PBS溶液稀釋為500 μg/mL。將待測樣品用去離子水稀釋10倍使其濃度盡量介于0～2.0 mg/mL之間。將200 μL工作液和10 μL稀釋樣品或標準品依次加入96孔內(nèi),每孔設一復孔,于37℃孵育15 min,使用酶標儀在570 nm波長下測定樣品和標準品的吸光度值,參照標準曲線,讀取樣品的蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法應用SPSS(Version 25.0)軟件進行相關(guān)統(tǒng)計學分析,兩組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿中外泌體的形態(tài)60例血漿樣本中均成功分離出外泌體,透射電鏡下可觀察到直徑在30～100 nm之間的外泌體囊泡狀結(jié)構(gòu),呈典型的圓盤狀形態(tài)(圖1),驗證為外泌體形態(tài)。

2.2 血漿外泌體粒徑分析電鏡驗證為外泌體形態(tài)后,進一步進行粒徑分析,結(jié)果顯示所得粒徑大小100 nm左右,濃度為(1.92×1010±2.12×109/mL),均符合外泌體的特征,進一步驗證為外泌體。

2.3 兩組認知功能評分比較觀察組 MoCA 總評分及注意、語言、執(zhí)行、記憶、計算力、定向力、視結(jié)構(gòu)技能評分均顯著低于健康組,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)(表1)。

圖1 透射電鏡下外泌體形態(tài)

表1 兩組MoCA評分比較分)

2.4 兩組間血漿外泌體濃度比較CSVD性認知障礙患者與正常對照血漿外泌體濃度分別為(4.62±1.37)mg/L、(5.83±1.77)mg/L,兩組比較差異顯著(P<0.05)(圖2)。

圖2 兩組外泌體中總蛋白的表達量

3 討論

血管性認知障礙是老年人中發(fā)病率較高的進展性認知障礙,起病比較隱秘,疾病初期局灶性癥狀較輕,進而發(fā)生癡呆,嚴重危害患者的身心健康[4]。腦小血管病是血管性癡呆最常見的病因,除了大血管病變的卒中能夠?qū)е抡J知水平下降外,CSVD亦是導致早期認知水平下降的重要原因[5];外泌體內(nèi)容物與血管性認知障礙密切相關(guān)。Prabhakar等[6]研究表明血漿miR-409-3p、miR-502-3p、miR-486-5p和miR-451a可用于區(qū)分小血管性血管性癡呆與健康對照。血漿神經(jīng)元性外泌體中的特定的突觸蛋白水平隨著AD的進展而下降,可以作為臨床前AD認知障礙的生物標志物[7]。血管性認知障礙患者血漿外泌體中miR-29c表達水平升高,提示miR-29c與認知功能障礙相關(guān)[8]。但是血漿外泌體在CSVD性認知障礙中的作用機制尚不清楚。

本文利用電鏡技術(shù)和粒徑分析方法對外泌體形態(tài)及大小進行了驗證,結(jié)果得到了具有特征的圓盤狀外泌體結(jié)構(gòu)。既往的研究多集中在腦脊液中的外泌體,本研究通過分離血漿中外泌體的方法,來探索CSVD性認知障礙患者與正常對照之間的外泌體濃度的的改變,結(jié)果顯示CSVD性認知障礙患者血漿中外泌體濃度低于正常對照,提示血漿外泌體與CSVD性認知障礙相關(guān);CSVD性認知障礙降低了患者注意、集中、語言、記憶和空間想象等認知能力,致使認知功能損傷。由于NPTX2和NRXNSα、AMPA4和NLGN1等蛋白與興奮性突觸活動相關(guān),研究者通過對于這兩對專門的突觸蛋白的血漿外泌體水平進行定量檢測以評估其生物標志物特征,結(jié)果顯示這些特異性興奮性突觸蛋白的血漿外泌體水平的降低可以指示認知喪失的程度[7]。輕度認知障礙患者血漿外泌體中的Aβ1-42濃度顯著增加,而神經(jīng)顆粒素(Ng)、突觸素、突觸結(jié)合蛋白濃度顯著降低[9]。本研究與上述研究結(jié)果一致,顯示外泌體內(nèi)容物與CSVD性認知障礙患者發(fā)病機制有關(guān),并成為其可能的生物標志物。本研究對兩組患者的MoCA評分進行了比較,顯示CSVD性認知障礙組的總體評分較對照組低。CSVD引起的認知功能障礙主要影響執(zhí)行力和注意力功能,而對記憶功能損害較輕,但在本研究中發(fā)現(xiàn)所有的認知域均發(fā)生了改變,可能是由于樣本量較小導致。CSVD尤其是影像學類型表現(xiàn)為多發(fā)性腔隙灶及白質(zhì)疏松的患者更易并發(fā)認知功能障礙[10]。多發(fā)腔隙性腦梗死患者梗死體積及梗死數(shù)量越多,認知功能障礙越嚴重,主要表現(xiàn)在顳葉、頂葉及額葉明顯[11]。一項中國城市社區(qū)為期7年的縱向研究顯示,白質(zhì)高信號與腦小血管疾病的進展和執(zhí)行功能的下降有關(guān)[12]。

綜上所述,本研究結(jié)果提示CSVD性認知障礙患者血漿外泌體濃度有所改變,先前已有研究證實了血漿外泌體在血管性認知障礙中的作用,進一步證實了血漿外泌體在CSVD性認知障礙患者中的研究價值,為研究CSVD性認知障礙的發(fā)生機制提供思路。但是血漿外泌體內(nèi)容物較多,micRNA、神經(jīng)顆粒素、突觸素、突觸結(jié)合蛋白等均會以不同的機制影響CSVD患者的認知情況,需要進一步擴大樣本量并且聚焦與發(fā)病有關(guān)的因子。