Claudin-4在膽囊癌中的表達(dá)及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系

王 勇,龐 青,滿忠然,談 燚,劉會(huì)春,金 浩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科,安徽 蚌埠 233004)

膽囊癌(Gallbladder carcinoma,GBC)是一種少見的惡性腫瘤,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。據(jù)最新報(bào)道,全球GBC的發(fā)病率約為2/10萬[1]。GBC的易感因素主要包括膽結(jié)石、慢性膽囊炎、慢性細(xì)菌性膽管炎、環(huán)境暴露等[2]。由于GBC起病隱匿,早期缺乏典型癥狀,大多數(shù)患者就診時(shí)已出現(xiàn)毗鄰臟器的侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致該腫瘤的預(yù)后較差[3]。據(jù)報(bào)道,GBC的5年總體生存率(Overall survival,OS)約為2.7%～20.1%[4]。迄今為止,GBC的相關(guān)預(yù)后因素尚未完全明確。既往研究表明,血清糖類抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9,CA19-9)水平、TNM分期、炎癥指標(biāo)等可能影響GBC患者的生存[4]。為改善GBC患者的預(yù)后,尋找新的治療靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物是目前研究的迫切需求。

緊密連接結(jié)構(gòu)的異常、細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)的破壞而引起的細(xì)胞增殖、分化異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[5]。Claudin-4在體內(nèi)廣泛表達(dá)并發(fā)揮特定的生理功能[6]。Claudin-4已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達(dá)異常且發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。最新研究表明,Claudin-4在上皮腫瘤中表達(dá)失調(diào),可作為轉(zhuǎn)移性上皮腫瘤和間質(zhì)腫瘤的鑒別指標(biāo)[7]。此外,Claudin-4在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中具有重要的作用[8-9]。然而,Claudin-4與GBC的關(guān)系,目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中,我們探討Claudin-4在GBC中的表達(dá)及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取自2014年1月至2018年12月間在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院住院的50例GBC患者為研究對(duì)象,其中男性20例,女性30例,平均年齡(63.2±9.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理診斷為膽囊腺癌;(2)年齡≤80歲;(3)接受GBC根治手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)轉(zhuǎn)移性膽囊惡性腫瘤;(2)伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;(3)接受姑息性手術(shù);(4)既往因GBC接受過化療、放療等治療;(5)隨訪資料不完整或無腫瘤組織標(biāo)本。選取同期接受手術(shù)的膽囊腺瘤和慢性膽囊炎患者各20例作為對(duì)照組。膽囊腺瘤組男3例,女7例,平均年齡(62.5±10.2)歲;慢性膽囊炎組男4例,女6例,平均年齡(62.1±8.7)歲。三組之間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究遵守赫爾辛基宣言[10]。

1.2 免疫組化法檢測(cè)Claudin-4的表達(dá)兔抗人Claudin-4多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;二抗羊抗兔IgG多克隆抗體購(gòu)自北京中衫金橋生物科技有限公司。采用二步法進(jìn)行免疫組化染色。膽囊組織經(jīng)石蠟包埋后連續(xù)切片4 μm,經(jīng)反復(fù)脫蠟、沖洗后抗原修復(fù)。加入一抗(1:200)在孵育盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。去除一抗后加入HRP標(biāo)記二抗,室溫下孵育15 min,顯色后觀察顯色強(qiáng)度。應(yīng)用蘇木素復(fù)染,顯微鏡觀察染色強(qiáng)度,調(diào)至合適強(qiáng)度。乙醇脫水、透明,中性樹膠封片。

免疫組化結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估,隨機(jī)觀察每張切片中10個(gè)高倍視野區(qū)域,細(xì)胞核或細(xì)胞漿染色為陽(yáng)性,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下。染色程度：0分：無染色;1分：輕度染為淡黃色;2分：中度染為棕黃色評(píng);3分：重度染為棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞比例：染色細(xì)胞/總細(xì)胞計(jì)數(shù)≤10%為0分;11%～30%評(píng)為1分;31%～50%評(píng)為2分;>50%評(píng)為3分。綜合評(píng)分：染色程度與陽(yáng)性細(xì)胞比例乘積：≥3分為陽(yáng)性,<3分為陰性。

1.3 資料收集及隨訪使用電子病歷收集以下數(shù)據(jù)：患者的年齡、性別、膽囊結(jié)石病史、CA19-9、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)、腫瘤分化、TNM分期等。隨訪至2019年6月或至患者死亡。隨訪內(nèi)容包括：術(shù)后每1～3個(gè)月復(fù)查生化常規(guī)、腫瘤指標(biāo)、腹部彩超及CT,記錄生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析我們采用SPSS 22．0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分類資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)。主要觀察結(jié)局為OS,采用KM生存曲線及l(fā)og-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析。將單因素分析中P<0.05的變量進(jìn)入多因素Cox回歸模型。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Claudin-4在GBC中的表達(dá)情況免疫組化檢測(cè)(圖1)提示,Claudin-4在GBC中的表達(dá)水平顯著高于慢性膽囊炎和膽囊腺瘤。GBC組織中Claudin-4的陽(yáng)性表達(dá)率為74%(37/50),顯著高于慢性膽囊炎20%(4/20)和膽囊腺瘤25%(5/20),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1,2=23.687,P<0.001)。慢性膽囊炎與膽囊腺瘤兩組之間Claudin-4的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Claudin-4免疫組化檢測(cè)(×100)

表1 Claudin-4在慢性膽囊炎、膽囊腺瘤及GBC組織中的表達(dá)情況

2.2 Claudin-4與GBC患者臨床病理特征的關(guān)系將患者根據(jù)Claudin-4表達(dá)情況分為陽(yáng)性(n=37)和陰性組(n=13),分析其與GBC臨床病理特征的關(guān)系。如表2所示,Claudin-4與CA19-9、腫瘤分化程度顯著相關(guān)。如圖2所示,Claudin-4陽(yáng)性的患者分化程度較低,CA19-9水平較高。

表2 Claudin-4與GBC患者臨床病理特征的關(guān)系

圖2 Claudin-4表達(dá)與CA19-9(A)及腫瘤分化程度(B)的關(guān)系

2.3 總體生存的對(duì)比患者術(shù)后KM生存曲線如圖3所示,log-rank檢驗(yàn)提示Claudin-4陽(yáng)性與陰性表達(dá)組之間OS差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)。

圖3 KM生存曲線及對(duì)比

單因素分析表明,術(shù)前CA19-9、腫瘤分化程度、TNM分期及Claudin-4表達(dá)是影響患者術(shù)后OS的因素(表3)。隨后,上述因素進(jìn)入Cox多因素回歸模型,結(jié)果表明,術(shù)前較高的腫瘤分化程度[HR=2.95,95%CI(1.15，7.60),P=0.025]、TNM分期[HR=3.6,95%CI(1.07，12.51),P=0.038]及Claudin-4表達(dá)[HR=4.81,95%CI(1.16，20.76),P=0.035]是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 影響OS的單因素和多因素分析

3 討論

近年來,GBC在我國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。GBC是最常見的膽道惡性腫瘤,占全球所有膽道惡性腫瘤的46%～95%[11]。該病在不同地區(qū)的發(fā)病率有差異,以智利、日本、印度北部發(fā)病率較高[1]。隨著影像和外科技術(shù)的進(jìn)步,GBC的診斷和治療水平有了很大的提高。然而,已經(jīng)確定的GBC的預(yù)后因素較少且價(jià)值有限,因而有必要探索新的生物標(biāo)志物。

Claudin-4是細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)的重要組成部分,其蛋白含有209個(gè)氨基酸,分子大小為22KD,屬于整合素蛋白家族,與產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素受體有極高的相似度。Claudin-4在多種腫瘤中表達(dá)異常且發(fā)揮了重要的作用。Duarte等檢測(cè)了Claudin-4在原位乳腺癌中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)88.4%(76/86)的患者表達(dá)水平升高,且Claudin-4高表達(dá)的乳腺癌患者有較差的無瘤生存率[8]。Moris等通過免疫組化檢測(cè)了Claudin-4在胃癌中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)66.7%的患者Claudin-4表達(dá)異常,且Claudin-4與腫瘤T分期顯著相關(guān),但不影響患者預(yù)后[9]。Sasaki等發(fā)現(xiàn)Claudin-4與胰腺癌腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),而靶向Claudin-4可增加化療藥物5-FU治療的有效性和安全性[12]。此外,Claudin-4的活性降低或表達(dá)缺失,可導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞的凋亡增加,細(xì)胞遷移能力減弱,動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷也降低[13]。在膽道系統(tǒng)腫瘤中,Ryu等研究表明,Claudin-4在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)顯著高于肝細(xì)胞肝癌,其可作為診斷肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的獨(dú)立標(biāo)志物[14]。國(guó)內(nèi)王云等[15]研究表明Claudin-4在膽管癌中高表達(dá),與膽管癌的分化程度相關(guān),且有助于膽管癌的早期診斷。

該研究中,我們首次探討了Claudin-4在GBC中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)74%的GBC患者Claudin-4表達(dá)陽(yáng)性,顯著高于慢性膽囊炎及膽囊腺瘤。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Claudin-4與CA19-9水平顯著正相關(guān),且Claudin-4陽(yáng)性的患者腫瘤分化程度較低。此外,Claudin-4還可用于指導(dǎo)GBC患者的預(yù)后。除Claudin-4之外,我們還發(fā)現(xiàn)TNM分期、腫瘤分化程度也是GBC患者獨(dú)立的預(yù)后因素,與既往研究的結(jié)果一致[4]。

然而,本研究仍有一些缺陷。首先,僅納入50例GBC患者,且均來源于我院,因此該研究結(jié)果需要多中心大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。其次,該研究缺少體外實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,后續(xù)需要通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Claudin-4在GBC中的作用及潛在機(jī)制。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了Claudin-4在GBC中的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值,有望為GBC的臨床診療及預(yù)后評(píng)估提供新的思路。