基于數(shù)據(jù)挖掘分析BTK基因在NSCLC中的表達及臨床意義

卜文超,郭 虹,陳世新,曾憲智,湯挺兵,關(guān)云茜

(麗水學(xué)院 1.醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院;2.炎癥相關(guān)疾病研究所,浙江 麗水 323000)

根據(jù)最新研究顯示,肺癌是常見的惡性腫瘤,肺癌在中國男性中發(fā)病率居惡性腫瘤的首位,女性肺癌患者發(fā)病率僅次于乳腺癌患者[1]。根據(jù)其臨床病理組織學(xué)分型可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞癌(NSCLC)。NSCLC約占肺癌患者總數(shù)的85%,5年的生存率僅為15%[2],且NSCLC患者在疾病的晚期還會出現(xiàn)明顯癥狀[3]。盡管最近化療有所進展,但NSCLC的治療效果極差。布魯頓酪氨酸激酶(bruton tyrosine kinase,BTK)是一種非受體激酶,屬于TEC家族酪氨酸激酶。近年來研究顯示BTK表達異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),BTK在致癌信號中起著至關(guān)重要的作用。BTK對于許多B細胞惡性腫瘤中白血病細胞增殖和存活至關(guān)重要[4]。BTK在幾種乳腺癌細胞系和腫瘤中表達,過表達的BTK抑制阿霉素誘導(dǎo)的乳腺癌細胞凋亡[5]。BTK在多種前列腺癌細胞系和腫瘤中表達升高[6]。然而目前BTK在NSCLC中的發(fā)生、發(fā)展過程、作用機制和預(yù)后方面,鮮有較為系統(tǒng)化的報道。本研究利用Oncomine、GEPIA、Kaplan-Meier Plotter等數(shù)據(jù)庫,基于高通量數(shù)據(jù)庫綜合分析BTK基因在NSCLC中的表達和臨床意義,以期發(fā)現(xiàn)NSCLC潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 BIOGPS數(shù)據(jù)庫分析BTK基因的表達情況應(yīng)用BIOGPS數(shù)據(jù)庫分析BTK基因在正常人體組織和不同類型細胞的表達情況。

1.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析BTK基因在腫瘤中的表達利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析BTK基因在腫瘤中的異常表達,并應(yīng)用Oncomine數(shù)據(jù)庫二次分析BTK在NSCLC的表達情況。判斷BTK在哪些腫瘤中會出現(xiàn)異常表達。設(shè)置檢索條件為：BTK,并點擊檢索;二次綜合分析的檢索條件：(1)基因：BTK;(2)分析類型：腫瘤VS正常;(3)腫瘤類型：肺癌;(4)數(shù)據(jù)類型：mRNA。默認系統(tǒng)設(shè)置的數(shù)值值,并根據(jù)臨界值(P-VALUE<1E-4,FOLD CHANGE≥2)內(nèi)設(shè)置的條件,在臨界值內(nèi)的數(shù)據(jù)集做二次分析。

1.3 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫在線分析BTK基因在NSCLC組織中的表達情況GIPIA數(shù)據(jù)庫的檢索條件設(shè)置為：(1)expression DIY:Boxplot;(2)Gene：BTK;(3)cancer name：LUAD and LUSC;(4)Matched Normal data：TCGA and GTEx,其余檢索條件按照默認值。

1.4 利用CCLE數(shù)據(jù)庫檢索BTK基因細胞系分析CCLE數(shù)據(jù)庫檢索條件設(shè)置為：輸入BTK后點擊“檢索”。

1.5 K-M Plotter分析NSCLC患者的生存周期K-M Plotter的檢索條件設(shè)置為：(1)mRNA：lung cancer;(2)Gene：BTK(探針：205504_at);(3)Survival:OS/DFS。采用系統(tǒng)中BTK表達的中位數(shù),作為高表達組與低表達組分組依據(jù),其余檢索條件按照默認值。利用K-M Plotter在線軟件分別分析BTK與NSCLC的生存分析,并分別分析其亞型LUAD和LUSC,其余檢索條件按照網(wǎng)站中的默認值設(shè)置。

1.6 The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫本研究應(yīng)用The Human Protein Atlas網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫BTK特異性抗體(No:HPA002028)分析BTK蛋白在正常肺組織和NSCLC中的表達。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法正常組織與NSCLC基因的表達差異采用t檢驗,不同數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)處理均采用該數(shù)據(jù)庫中自帶在線統(tǒng)計學(xué)系統(tǒng)進行分析,所有數(shù)據(jù)的處理均以雙側(cè)P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BTK基因在正常人體組織和細胞中的表達情況通過BIOGPS數(shù)據(jù)庫檢索分析可知,BTK在人體各個正常組織中廣泛表達,在多種免疫細胞中高表達,如在CD19+B淋巴細胞和CD14+單核巨噬細胞表達量相對較高,見圖1。

圖1 BioGPS數(shù)據(jù)庫中BTK基因在正常人體組織和細胞中的表達情況

2.2 BTK在不同腫瘤類型中的表達情況Oncomine數(shù)據(jù)庫平臺共收集362項不同癌癥組織芯片BTK的表達研究結(jié)果,其中17項表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,在4項研究中BTK表達增高,13項研究中表達降低,其中BTK在結(jié)直腸癌、肺癌、肉瘤等腫瘤中表達降低,在乳腺癌中表達增高,見圖2A。根據(jù)檢索條件共得出3項研究符合,此研究文章發(fā)表在Genome Res[7]和PLoS One[8]雜志中。對3項研究共272例樣本進行Mate分析,發(fā)現(xiàn)BTK在NSCLC中處于低表達狀態(tài),其P值為7.05E-10,見圖2B。

圖2 BTK基因在Oncomine數(shù)據(jù)庫不同類型腫瘤中的表達情況及其在NSCLC研究中的Meta分析

2.3 BTK mRNA在組織中的表達情況通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),BTK mRNA在LUAD和LUSC組織中的表達顯著低于正常對照組(P<0.05),表明BTK基因在LUSC(圖3A)和LUAD(圖3B)中處于低表達水平。

圖3 GEPIA數(shù)據(jù)庫中BTK在不同NSCLC研究芯片中的表達

2.4 CCLE對BTK進行細胞系分析CCLE分析結(jié)果顯示,BTK在NSCLC細胞系中處于低表達狀態(tài),并且在37類癌細胞中處于第26位(圖4)。

2.5 BTK基因表達水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系為明確BTK表達水平對NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系,使用K-M plotter數(shù)據(jù)進行在線分析,共篩選出1926例不同類型的肺癌組織樣本。K-M plotter分析結(jié)果顯示：BTK表達水平對NSCLC患者總體生存率(Overall Survival,OS)具有顯著影響,相較于高表達組,BTK低表達的患者OS顯著高于高表達組患者(P<0.05)(圖5A)。進一步亞組分析發(fā)現(xiàn)：在肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LUAD)組織中BTK高表達患者OS顯著下調(diào)(P<0.05)(圖5B),而在肺鱗狀細胞癌(Lung squamous cell carcinoma,LUSC)組織中BTK高表達組和低表達組OS未顯示出明顯的差異性(P>0.05)(圖5C)。

圖4 CCLE對BTK基因細胞系分析結(jié)果

圖5 BTK表達與NSCLC總生存期之間的關(guān)系

2.6 BTK蛋白在肺癌中的表達情況應(yīng)用The Human Protein Atlas網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫檢索BTK特異性抗體(No:HPA001198),分析BTK蛋白在正常肺組織和NSCLC中的表達情況。其中數(shù)據(jù)庫中有3例正常肺組織抗體染色為中等程度,其陽性表達部位在肺組織巨噬細胞中,而肺實質(zhì)細胞中未檢測到陽性表達(圖6A)。在NSCLC組織樣本中,LUAD(圖6B)和LUSC(圖6C)的抗體染色均未檢測到其表達。

圖6 人類蛋白圖譜項目中BTK蛋白在正常肺組織和NSCLC中的表達情況

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中位居首位。肺癌根據(jù)其臨床病理組織學(xué)分型,可分為SCLC和NSCLC。肺癌的治療方案包括放療、化療、手術(shù)和靶向治療。治療模式取決于癌癥的類型和處于的病情階段,盡管隨著醫(yī)療水平的不斷發(fā)展,其診斷和治療方式均有所改善,但肺癌的預(yù)后仍不盡人意,因此更好的了解NSCLC潛在的治療靶點和 預(yù)后的標志物變得尤為重要[9],可為今后開發(fā)更為有效和具體的藥物治療靶點提供依據(jù)。

BTK是一種非受體酪氨酸激酶,是Tec激酶家族。BTK是B細胞受體(BCR)、toll樣受體和Fc受體的下游信號分子[10]。BTK在致癌信號中起著重要作用,這對各種B細胞惡性腫瘤中的白血病細胞的生存尤為重要[11]。BTK小分子抑制劑依魯替尼是治療血液惡性腫瘤的藥物[12],然而依魯替尼在實體瘤中沒有達到較好診治效果,且BTK在NSCLC中少見較為系統(tǒng)的研究。

BIOGPS是一個基因為中心的門戶[13-14]。BIOGPS數(shù)據(jù)庫可顯示多種基因在正常組織和細胞中轉(zhuǎn)錄情況,通過檢索BIOGPS數(shù)據(jù)庫,BTK在正常肺組織中表達。Oncomin數(shù)據(jù)庫為癌癥微列陣數(shù)據(jù)庫和基于網(wǎng)絡(luò)挖掘平臺數(shù)據(jù)庫,可進行不同腫瘤亞型與正常組織之間進行差異表達分析[15]。最新的Oncomine版本包括715個數(shù)據(jù)集和86733個樣本,主要整合了TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表的文章。本研究通過Oncomine數(shù)據(jù)庫分析BTK基因異常表達與結(jié)直腸癌、腎癌、白血病、肺癌、肉瘤有關(guān),其中共有3項NSCLC的研究符合參數(shù)閾值設(shè)置[7-8]。Oncomine綜合分析可知BTK在NSCLC中處于低表達水平。GEPIA基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的9736個腫瘤和8587個正常樣本的基因表達分析,可進行差異表達分析、生存分析等[16]。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫進一步亞組分析BTK在LUAD和LUSC中都處于低表達水平。通過檢索Oncomine和GEPIA數(shù)據(jù)庫,BTK在NSCLC及其亞組中處于低表達狀態(tài)。CCLE數(shù)據(jù)庫包含了947個人類癌細胞系的基因表達[17]。通過CCLE數(shù)據(jù)庫分析可知,BTK在NSCLC細胞系中轉(zhuǎn)錄水平處于低表達狀態(tài)。多個數(shù)據(jù)庫顯示BTK在NSCLC組織中和NSCLC細胞系中均處于低轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。Kaplan-Meier plotte可以很快速查找的基因與肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌5種腫瘤的關(guān)系[18]。在本研究中,K-M plotter數(shù)據(jù)庫進行在線分析BTK在NSCLC中,高表達的BTK的在NSCLC中有更高的生存率。HPA數(shù)據(jù)庫中主要是應(yīng)用特制抗體用免疫組織化學(xué)檢測正常組織和腫瘤組織中蛋白的表達[19],可見BTK在NSCLC中處于低表達。Bi等[20]也基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析NSCLC中腫瘤微環(huán)境可能由免疫狀態(tài)轉(zhuǎn)向代謝狀態(tài)時BTK降低,低表達的BTK在LUAD中有更好的預(yù)后。

總之,利用高通量數(shù)據(jù)庫可以快速檢索特定基因在特定腫瘤中的表達水平。借助整合后的高通量數(shù)據(jù)庫可以篩查腫瘤潛在的治療靶點,為進一步的研究提供了理論依據(jù)和方向,也避免了研究的盲目性,縮短了研究周期。本研究采用高通量數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)的闡述了BTK在NSCLC表達水平和臨床意義,然而目前尚無BTK轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平定量的研究報道,今后將繼續(xù)開展此方面的深入研究,以進一步探討和驗證BTK在NSCLC中潛在的作用機制和臨床意義。