miR-9-3p對ConA誘導(dǎo)的小鼠慢性實驗性肝損傷的影響

王 闖,王 猛,聶 影,文怡欣,劉 野,鄂志野,鞠寶玲,張紅軍

(牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,黑龍江 牡丹江 157011)

肝纖維化是肝臟持續(xù)損傷的一種的組織修復(fù)過程[1],其形成機制復(fù)雜,主要與轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)及其家族成員等多種促纖維化細(xì)胞因子誘導(dǎo)肝星形細(xì)胞(Hepatic Stellate Cells,HSC)的活化有關(guān),因此抑制HSCs的激活,可以有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化[2]。微小RNA(miRNA)可以調(diào)節(jié)多種靶基因表達(dá),在肝臟具有廣泛的生物學(xué)功能,本研究通過高通量測序發(fā)現(xiàn),在ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷模型小鼠肝臟組織存在miRNA-9-3p的差異表達(dá),肝損傷模型小鼠肝臟miRNA-9-3p表達(dá)明顯下降;因此本研究通過慢病毒載體介導(dǎo)在肝損傷小鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-9-3p,探討miRNA-9-3p在免疫性肝損傷發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗小鼠為清潔級BALB/c小鼠,牡丹江醫(yī)學(xué)院動物中心,實驗取年齡8～10周齡40只小鼠,在溫度為(24±2)℃無菌的SPF動物房飼養(yǎng),晝夜光照12 h,自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)的小鼠飼料。所有實驗動物均按照機構(gòu)動物說明以人道的方式進(jìn)行。本研討已取得牡丹江醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 實驗試劑 慢病毒包裝miRNA-9-3p載體構(gòu)建、濃縮及純化及慢病毒空載體(吉凱基因生物有限公司)、伊紅、蘇木素染色液(HE染色)、刀豆蛋白A(ConA,Sigma)、分離膠促凝標(biāo)本管等。

1.1.3 實驗儀器 包埋機、旋轉(zhuǎn)式切片機、烘片機、生物顯微鏡(德國 Leica)、電子天平、低溫離心機(美國Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 高通量測序檢測免疫性肝損傷模型小鼠microRNA的差異表達(dá) 實驗小鼠12只隨機分成對照組、ConA損傷組各6只。ConA組給予尾靜脈注射ConA 8 mg/kg,每周1次,連續(xù)8周;對照組給予尾靜脈注射等量的生理鹽水。ConA末次給藥第7天,處死小鼠,冷凍送檢,由廣州銳博生物科技有限公司完成測序檢測(Illumina HiSeqTM 2500測序所得的原始數(shù)據(jù))。

1.2.2 動物實驗設(shè)計 取40只BALB/c小鼠正常飼養(yǎng)一周,隨機分成對照組、ConA損傷組、過表達(dá)組(ConA+慢病毒包裝miR-9-3p組)、過表達(dá)對照組(ConA+慢病毒空載體組)每組10只;各模型組小鼠經(jīng)尾靜脈按8 mg/kg體重注射ConA 每周1次(對照組注射等體積生理鹽水),連續(xù)8周,過表達(dá)組于第7周開始,慢病毒包裝的miR-9-3p過表達(dá)質(zhì)粒2×107TU/mL,尾靜脈給藥每周1次,共2周;過表達(dá)對照組注射等量慢病毒空載體。

1.2.3 標(biāo)本采集 于ConA末次給藥第7天,活體稱重后,摘取各實驗組小鼠眼球后采集新鮮靜脈血標(biāo)本,留置于分離膠抗凝標(biāo)本管內(nèi),靜置1 h,按3000 r/min分離心10 min,離心后取上層清亮血清標(biāo)本。測定所取得小鼠血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotrans-ferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotrans- ferase,AST)。取血完成后頸椎離斷處死小鼠,立即將小鼠置于冰上解剖,順次完整取出肝臟、脾臟等主要器官,除去脂肪和筋膜,放入電子天平上稱重并且拍照,并迅速將肝分成兩部分。一部分浸入4%甲醛留做HE染色,另一部分切割為重量100 mg/EP管的小塊后迅速放入凍存管并放入液氮隔夜12 h后,放到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 血清酶學(xué)檢測 血清AST和ALT檢測使用牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院檢驗科邁瑞B(yǎng)S-2000全自動生化分析儀,檢測步驟按制造廠商提供的說明書操作。

1.2.5 蘇木素-伊紅染色 制作好的石蠟切片放入烘箱2 h,然后放入二甲苯中標(biāo)本經(jīng)10% pH 7.0福爾馬林固定,石蠟包埋,行常規(guī)蘇木精-伊紅染色法,在生物顯微鏡鏡下重點觀察組織構(gòu)成及形態(tài)學(xué)特點、細(xì)胞密度、大小、形態(tài)、有無變性。

1.2.6 肝臟及脾臟指數(shù) 臟器指數(shù)(%)=臟器重量(g)/體重(g)×100;按公式計算肝臟、脾臟指數(shù)。

1.2.7 Western Blot檢測平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原(COL1A1)蛋白表達(dá) 將收集的肝臟組織用生理鹽水洗滌后,加入RIPA(強)裂解液后充分研磨,提取總蛋白,用超微量蛋白檢測儀檢測蛋白質(zhì)濃度,取各蛋白樣品30 μg變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加一抗(1:1000)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗,孵育2 h,使用ECL熒光底物試劑盒顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。兩組間數(shù)據(jù)符合正態(tài)性用獨立樣本t檢驗進(jìn)行比較,否則運用非參數(shù)檢驗進(jìn)行比較,P<0.05為顯著差異,P>0.05為無顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 ConA誘導(dǎo)肝損傷模型鑒定經(jīng)尾靜脈將ConA注射到小鼠體內(nèi)8周,誘導(dǎo)實驗性慢性肝損傷,通過檢測血清中轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST)的變化,發(fā)現(xiàn)相比正常對照組,ConA損傷組轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)的含量明顯升高(如圖1A、1B所示)。HE染色可觀察到ConA組出現(xiàn)明顯的細(xì)胞水腫,小葉內(nèi)的細(xì)胞壞死,并且有較多的淋巴細(xì)胞的浸潤(如圖1C、1D所示),提示ConA誘導(dǎo)肝損傷的模型成功。

圖1 血清酶學(xué)檢測及HE染色評估ConA誘導(dǎo)的肝損傷模型(×200,50 μm)

2.2 高通量測序檢測與正常組對比,miR-9-3p在ConA誘導(dǎo)的慢性實驗性肝損傷模型動物肝臟組織中表達(dá)下調(diào)(圖2)。

2.3 組織學(xué)檢測

2.3.1 肝臟大體標(biāo)本肉眼觀 肉眼觀察對照組小鼠肝臟體積正常,質(zhì)地柔軟,有光澤(如圖3A);ConA誘導(dǎo)肝損傷模型小鼠肝組織：肝臟質(zhì)地變韌,顏色暗淡發(fā)白、表面呈小結(jié)節(jié)狀增生,可見點片狀壞死灶(如圖3D);比較ConA損傷模型組miR-9-3p過表達(dá)后肝組織大體改變也明顯減輕,肝臟表面光滑,顆粒樣改變明顯減少,點狀壞死消失(如圖3B);過表達(dá)對照組與ConA損傷模型組比較,組織損傷未見明顯改善(如圖3C)。

圖2 高通量測序檢測小鼠肝臟組織中miRNA的表達(dá)

圖3 各組小鼠肝臟大體標(biāo)本

2.3.2 各組小鼠肝臟組織 HE染色結(jié)果 正常對照組肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞排列規(guī)則,肝小葉輪廓分明,肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列,肝細(xì)胞無變性壞死,亦無炎性反應(yīng),匯管區(qū)亦無纖維組織增生或炎性病變(圖4A);ConA損傷組肝小葉肝索結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞腫脹、體積增大,細(xì)胞質(zhì)疏松,局部分炎性細(xì)胞浸潤、出血(圖4D);與ConA損傷組(圖4C)相比,在經(jīng)過miR-9-3P過表達(dá)后肝組織細(xì)胞水腫,肝小葉內(nèi)的細(xì)胞壞死及淋巴細(xì)胞的浸潤均有不同程度的減輕現(xiàn)象(圖4B)。

圖4 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)改變(×200,50 μm)

2.3.3 對臟器系數(shù)的影響 由圖5可知,注射ConA能誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷并且升高小鼠的肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù),但正常組與各組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);ConA損傷組肝臟指數(shù)和脾臟系數(shù)偏大,與過表達(dá)組存在顯著性差異(P<0.05)。

圖5 各組小鼠臟器系數(shù)

2.4 過表達(dá)miR-9-3p減低肝損傷中血清酶ALT、AST含量血清ALT和AST水平是衡量肝臟功能是否正常的主要指標(biāo),血清學(xué)檢測可見與對照組相比,ConA損傷組ALT、AST水平明顯升高,然而miR-9-3P過表達(dá)組可見血清ALT、AST水平顯著下降(圖6),與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

圖6 各組小鼠血清ALT、AST水平

2.5 miR-9-3p過表達(dá)抑制實驗性肝損傷動物肝臟組織COL1A1及α-SMA蛋白的表達(dá)ConA 給藥后實驗動物肝臟組織α-SMA、COL1A1蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào),與NC對照組比較差異顯著(P<0.05),提示ConA誘導(dǎo)的慢性肝損傷過程中存在HSC的激活,而模型小鼠肝內(nèi)過表達(dá)miR-9-3p后,α-SMA、COL1A1蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào),與損傷組相比差異顯著(P<0.05),提示肝內(nèi)過表達(dá)miR-9-3p可以逆轉(zhuǎn)ConA誘導(dǎo)的HSC活化(圖7)。

圖7 各組小鼠肝組織COL1A1和α-SMA蛋白的表達(dá)

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病的病理改變過程,其防治手段一直是眾多學(xué)者的研究熱點。miRNAs是一組小的非編碼RNA,負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[3]。越來越多的證據(jù)表明,miRNAs在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、增殖和凋亡中起著至關(guān)重要的作用[4-5],異常表達(dá)的miRNAs與多種疾病發(fā)生有關(guān),既往研究已證實miR-9-3p異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6-9],但是在不同的腫瘤細(xì)胞中,miR-9-3p所起的生物學(xué)效應(yīng)存在較大差異?；赯hang等[10]的研究結(jié)果,推測miR-9-3p在乳頭狀甲狀腺癌中可能具有類似癌基因的作用。Li等[11]發(fā)現(xiàn) miR-9-3p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并通過激活A(yù)MP相關(guān)的蛋白激酶通路來促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。但是Caviglia等[12]發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中miR-9-3p表達(dá)下調(diào)并通過作用于成纖維細(xì)胞生長因子來抑制肝癌細(xì)胞的增殖。T Higashi[13]等發(fā)現(xiàn)miR-9-3p通過靶向肝細(xì)胞癌細(xì)胞TAZ(WWTR1)發(fā)揮腫瘤抑制作用。

在本研究中,通過ConA誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠的免疫性肝損傷模型,經(jīng)高通量測序發(fā)現(xiàn)存在差異性表達(dá)的miRNAs,其中miR-9-3p在模型小鼠肝組織中表達(dá)明顯下調(diào);通過慢病毒介導(dǎo)模型小鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-9-3p后,實驗小鼠血清ALT和AST水平量比ConA損傷模型組明顯減低,比較ConA損傷模型組肝組織大體改變也明顯減輕,肝臟表面光滑,顆粒樣改變明顯減少,點狀壞死消失。HE組織病理學(xué)學(xué)檢測也發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)后肝組織細(xì)胞的水腫以及炎細(xì)胞浸潤明顯減弱。由此本研究推斷miR-9-3p可減弱Con A誘導(dǎo)所致小鼠慢性實驗性肝損傷,提示miR-9-3p可能參與免疫性實驗性肝損傷的發(fā)生和發(fā)展。

肝纖維化的特征病理表現(xiàn)為膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積,其形成機制復(fù)雜,主要由TGF-β等多種促纖維化細(xì)胞因子誘導(dǎo)HSC的活化,產(chǎn)生大量膠原等ECM沉積于肝臟組織中,因此抑制HSC的活化對逆轉(zhuǎn)肝纖維化的形成具有重要的研究意義。α-SMA、COL1A1為HSC活化的特征性標(biāo)志[14],本研究檢測顯示ConA 給藥后實驗動物肝臟組織α-SMA,COL1A1蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào),模型鼠體內(nèi)過表miR-9-3p后,α-SMA、COL1A1的蛋白表達(dá)的水平明顯減低,說明miR-9-3p對HSC的活化具有明顯的抑制作用。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)了miR-9-3p在ConA誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型中表達(dá)明顯下降,體內(nèi)過表達(dá)miR-9-3p可以抑制實驗小鼠的HSC活化,減弱Con A誘導(dǎo)所致小鼠慢性實驗性肝損傷,但由于肝損傷進(jìn)展及纖維化過程中又受到多種細(xì)胞因子的影響,miR-9-3p作為小的非編碼RNA,負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),在這一過程中其參與調(diào)控的靶向分子,還有待于進(jìn)一步實驗研究。