慶大霉素發(fā)酵液檢測方法研究

張莉萍，牛 春，石彥鵬， 張 萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750002)

慶大霉素(Gentamicin，GM)主要是由絳紅小單孢菌(MicromonosporaPurpurea)和棘孢小單孢菌(M.echinospora)發(fā)酵產(chǎn)生的一種氨基糖苷類廣譜抗生素，對多數(shù)革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌均有較強的抗菌作用，是臨床上廣泛使用的抑菌抗生素之一[1]。

慶大霉素因自身沒有紫外吸收特性，其效價檢測一直以來是國內(nèi)研究熱點。主要檢測方法有微生物檢測法、旋光法和衍生法，目前這些檢測方法通常只用于較純的慶大霉素制劑濃度分析。在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，由于發(fā)酵液中的成分比較復雜，且對發(fā)酵液效價檢測一般要求需要多次重復的快速檢測，微生物檢測法操作步驟繁瑣復雜、且耗時長，本實驗利用慶大霉素的旋光性以及慶大霉素氨基糖苷上的氨基與特定化合物發(fā)生衍生反應原理，分別采用旋光法、紫外分光光度衍生法和高效液相色譜衍生法測定降紅小單孢菌發(fā)酵生產(chǎn)的慶大霉素發(fā)酵液效價，通過比較各檢測方法測定的效價含量篩選出最適合慶大霉素發(fā)酵液的效價檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株 絳紅小單孢菌(Micromonospora purpurea)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號4.5706。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 斜面培養(yǎng)基(%)及培養(yǎng)條件：可溶性淀粉1.0%，NaCl20.05%，KNO30.1%，CaCO30.1%，K2HPO40.03%，麩皮2.0%，MgSO40.05%，瓊脂2.0%，天冬素0.002%，pH7.40～7.60，37 ℃培養(yǎng)7 d[2]。

種子培養(yǎng)基(%)及培養(yǎng)條件：葡萄糖0.1%，玉米淀粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白胨0.2%，黃豆餅粉1.0%，CaCO30.6%，COCl21 ug/mL，KNO30.05%，植物油0.2%，pH自然，34 ℃培養(yǎng)24 h[3]。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%)及培養(yǎng)條件：葡萄糖0.5%、玉米淀粉5.0%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.6%、黃豆餅粉3.0%、CaCO30.7%、COCl20.001%、(NH4)2SO40.1%、KNO30.15%、淀粉酶0.02%和泡敵0.03%，pH7.50～7.60，33 ℃培養(yǎng)4 d[4]。

1.1.3 試劑 慶大霉素標準品 (中國藥品生物制品檢定所，純度為 638 u/mg)；甲醛(分析純)；乙酰丙酮(分析純)；鄰苯二甲醛(OPA)；甲醇(分析純)；巰基乙酸(分析純)異丙醇(分析純)；庚烷磺酸鈉(分析純)；甲酸(分析純)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化 起始發(fā)酵工藝是待斜面孢子成熟后，刮取成熟孢子2 cm2于裝有30 mL種子培養(yǎng)液的300 mL直口三角瓶中，34 ℃培養(yǎng)24 h，將擴培活化的種子液按10%接種量轉入裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的300 mL直口三角瓶中，33 ℃培養(yǎng)4 d。本文分別對種瓶接種量和種齡、發(fā)酵瓶接種量和發(fā)酵周期進行優(yōu)化。

1.2.2 發(fā)酵液預處理 用6 mol/L的硫酸溶液將發(fā)酵液酸化至pH1.8-2.0，靜置30 分鐘后過濾，濾液待用。

1.2.3 旋光法 標準曲線繪制：精密稱取慶大霉素標準品適量，分別加水配制成4、6、8、10和12 mg/mL不同濃度的標準溶液，放置自動旋光儀測定旋光度值，標繪制標準曲線。

效價檢測：濾液用20%氫氧化鈉調(diào)pH至6.0-7.0，加入陽離子交換樹脂吸附，再用0.5 mol/L的硫酸溶液解析[5]，解析液放置自動旋光儀測定旋光度值。

1.2.4 紫外分光光度衍生法 標準曲線繪制：精密稱取慶大霉素標準品適量，加水配制標準品儲存溶液，分別用水稀釋至濃度20 u/mL、40 u/mL、60 u/mL、80 u/mL和100 u/mL，精密吸取各濃度標準品2 mL置25 mL比色管中，衍生步驟同發(fā)酵液樣品。

效價檢測：將濾液稀釋到標準曲線范圍內(nèi)待用。精密吸取稀釋濾液2 mL置25 mL比色管中，加衍生劑乙酰丙酮-甲醛溶液5 mL(乙酰丙酮-甲醛溶液配制參考文獻[6])，沸水浴30 min，室溫冷卻，精密加入純化水7 mL，充分混勻，于339 nm波長處測定吸收度。以純化水經(jīng)同樣處理后作空白對照。

1.2.5 高效液相色譜(HPLC)衍生法 標準品配制：精密稱取慶大霉素標準品，加水配制成10 mg/mL的標準品儲存溶液，4 ℃冰箱保存，臨用時稀釋進行測定。

效價檢測：精密吸取濾液4 mL置25 mL比色管中，加衍生劑OPA1.6 mL(OPA溶液配制參考文獻[5])，加異丙醇至10 mL，搖勻，60 ℃水浴15 min，至于冰水中終止反應，12 000 r/min離心5 min，取上清待測。色譜流動相為庚烷磺酸鈉水溶液(5 g/L)∶甲醇∶甲酸=21∶5∶74；波長330 nm。以純化水經(jīng)同樣處理后作空白對照。

2 結果與分析

2.1 種瓶接種量和種齡對發(fā)酵水平的影響 本文分別刮取斜面生長成熟的孢子1 cm2、2 cm2和3 cm2到種瓶，每隔4 h測種瓶菌體含量，每隔8 h轉發(fā)酵，探究種瓶接種量和種齡對慶大霉素效價的影響。

圖1 種子液生長曲線Fig 1 The growth curve of Seed

種子生長曲線如圖1所示，當孢子接種量為1 cm2時，降紅小單孢菌從培養(yǎng)第20 h進入對數(shù)生長期，48 h后進入平穩(wěn)期，當接種量為2 cm2時，從培養(yǎng)第12 h進入對數(shù)生長期，40 h后進入平穩(wěn)期，當接種量為3 cm2時，培養(yǎng)8 h后，降紅小單孢菌快速進入對數(shù)生長期，32 h后菌體生長開始下降。從發(fā)酵水平來看，種瓶接種量2 cm2和種齡24 h組合的慶大霉素發(fā)酵液效價最高(表1)。這說明種瓶接種量與種齡相互影響，孢子量過大會導致種瓶培養(yǎng)基中菌絲體生長旺盛，提前進入對數(shù)生長期，過小則會延遲進入對數(shù)生長期。通常種齡以菌絲處于生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達到最高峰時為宜。若過于年輕的種子接入發(fā)酵瓶，往往會出現(xiàn)前期生長緩慢而使整個發(fā)酵周期延長，產(chǎn)物開始形成的時間推遲甚至會因菌體量過少而在發(fā)酵瓶內(nèi)結球，造成異常發(fā)酵的情況。而過老的種子則會造成生產(chǎn)能力下降，菌體過早自溶。

表1 種瓶接種量與種齡組合結果的效價分析Tab 1 Potency analysis of the combination of seed bottle inoculation volume and seed age

2.2 發(fā)酵瓶接種量、發(fā)酵周期和發(fā)酵液pH值對慶大霉素含量的影響 在最優(yōu)的種瓶接種量和種齡條件下，我們分別選取8%、10%、12%和14%接種量，從發(fā)酵第3 天開始每天放瓶，分別用旋光法、紫外分光光度法和HPLC法測定發(fā)酵液效價。

隨著發(fā)酵周期延長，慶大霉素發(fā)酵液的pH整體呈現(xiàn)增長趨勢(圖2)，而效價呈現(xiàn)先增后減趨勢(表2)。當接種量為8%和10%時，發(fā)酵第6 天效價達到最高，分別為2179 u/mL和3159 u/mL，此時發(fā)酵液pH接近7.5；當接種量為12%時，發(fā)酵第5 天達到最高效價4217 u/mL，發(fā)酵液pH接近7.5；接種量為14%時，搖瓶效價整體偏低(表2)。這說明發(fā)酵瓶接種量與發(fā)酵周期也相互影響，降紅小單孢菌生產(chǎn)慶大霉素的最佳pH為7.5左右。發(fā)酵瓶接種量的大小決定了生產(chǎn)菌種在發(fā)酵瓶中的生產(chǎn)繁殖速度。較大的接種量可以縮短發(fā)酵瓶中菌絲繁殖到達高峰的時間，使次級代謝產(chǎn)物的形成提前到來，且在生產(chǎn)菌迅速占據(jù)整個培養(yǎng)環(huán)境時，減少雜菌生長機會。但若接種量過多會導致菌絲生長過快，使培養(yǎng)液黏度增加，造成溶解氧不足而影響代謝產(chǎn)物的形成。

圖2 發(fā)酵液pH變化Fig 2 The pH change of fermentation broth

表2 發(fā)酵瓶接種量與發(fā)酵周期組合結果的效價分析Tab 2 Potency analysis of the combined results of fermentation flask inoculation volume and fermentation cycle

2.3 紫外分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)和旋光法的比較 紫外分光光度法的標準曲線如圖3所示，當慶大霉素濃度在20～100 u/mL之間，其與吸光值呈現(xiàn)較好的線性關系，得線性方程y=156.8x+4.5085，其中y為濃度，x為吸光值，相關系數(shù)r2=0.9998。旋光法的標準曲線如圖4所示，當慶大霉素濃度在4～12 mg/mL之間，其余旋光值呈現(xiàn)較好的線性關系，得線性方程y=2.2607x+1.9098，其中y為濃度，x為吸光值，相關系數(shù)r2=0.9992。

圖3 紫外分光光度法的標準曲線Fig 3 Standard curve of ultraviolet spectrophotometry

圖4 旋光法的標準曲線Fig 4 Standard curve of polarimetry

分別以優(yōu)化前和優(yōu)化后的發(fā)酵工藝為培養(yǎng)條件，搖瓶發(fā)酵獲得慶大霉素發(fā)酵液。優(yōu)化前和優(yōu)化后的發(fā)酵液效價檢測結果如表3所示。發(fā)酵工藝優(yōu)化前，三種檢測方法測得的慶大霉素發(fā)酵液效價約為2600～2700 u/mL，平均相對偏差均小于2%；發(fā)酵工藝優(yōu)化后，三種檢測方法測得的慶大霉素含量約為4500～4700 u/mL，平均相對偏差均小于3%。整體來看，三種檢測方法測定的慶大霉素發(fā)酵液效價相差不大。因此，三種檢測方法都能運用在慶大霉素發(fā)酵液效價快速檢測中。

表3 三種檢測方法測定發(fā)酵工藝優(yōu)化前后發(fā)酵液效價的比較Tab 3 Comparison of three methods for determining the potency of fermentation broth before and after fermentation process optimization

3 討論與結論

主要進行了慶大霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化以及旋光法、紫外分光光度法和高效液相色譜法三種不同慶大霉素發(fā)酵液檢測方法在慶大霉素發(fā)酵液效價檢測中的比較研究。

在發(fā)酵工藝優(yōu)化中，最佳種瓶接種量和種齡的組合為刮取成熟孢子2 cm2于種子培養(yǎng)液，活化培養(yǎng)24 h轉接發(fā)酵瓶。最佳發(fā)酵瓶接種量和發(fā)酵周期的組合為按發(fā)酵培養(yǎng)液體積的12%吸取種子液到發(fā)酵瓶，搖瓶培養(yǎng)5 d后放瓶。發(fā)酵工藝優(yōu)化后的慶大霉素發(fā)酵液效價相較于優(yōu)化前提高70%左右。

旋光法、紫外分光光度法和高效液相色譜法三種檢測方法都能運用在慶大霉素發(fā)酵液效價快速檢測中。旋光法操作簡單但其對標準品需求量大，紫外分光光度法和高效液相色譜法均需要經(jīng)過衍生反應，高效液相色譜法需要出峰時間但能測得慶大霉素各組分含量，紫外分光光度法耗時短但只能測定慶大霉素總體效價。因此在慶大霉素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，若對時間要求緊迫，可選擇紫外分光光度法，若對慶大霉素各組分含量需要定量分析，則可選擇HPLC 法作為首選檢測方法。