血清4型禽腺病毒強(qiáng)毒株GY株的分離鑒定和致病性研究

侯力丹，王 嘉，劉 丹，陳曉春，翟天舒，楊承槐，楊漢春，毛婭卿*，李俊平*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，F(xiàn)AdV)是雞、鴨等禽體內(nèi)常見(jiàn)的傳染性病毒之一。自2015年6月以來(lái)，我國(guó)山東、河南、河北等省份的部分地區(qū)雞群中發(fā)生了以心包積液和肝臟腫大為特征的傳染病。經(jīng)過(guò)大量的研究，確定該病是由血清4型的I群FAdV所引起[1]。在我國(guó)五個(gè)省市的家禽養(yǎng)殖場(chǎng)，發(fā)現(xiàn)至少有三種FAdV (FAdV-C、FAdV-D、FAdV-E)的流行，并且在包涵體肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)和心包積水綜合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome, HPS)病例中的混合感染很常見(jiàn)[2-4]。Chen等[5]在2015-2018年收集我國(guó)15個(gè)省市共計(jì)280份病料，發(fā)現(xiàn)155份存在有腺病毒感染，其中FAdV-4型占比79.4%，F(xiàn)AdV-8a型占比13.5%，F(xiàn)AdV-8b型占比3.9%。

近年來(lái)，為了防控禽腺病毒病，我國(guó)通過(guò)不同的方式開(kāi)展了疫苗研制工作，而在疫苗研制過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)化且毒力穩(wěn)定的檢驗(yàn)強(qiáng)毒株是評(píng)價(jià)疫苗的重要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本研究于2016年從山東地區(qū)發(fā)生心包積液的疑似腺病毒感染雞群中采集病料進(jìn)行了病毒分離鑒定，獲得1株血清4型FAdV GY株，并對(duì)其進(jìn)行了純化、鑒定、種子批的建立和致病力的測(cè)定，以期通過(guò)研制提供可靠的檢驗(yàn)用強(qiáng)毒株，為疫苗的研制和評(píng)價(jià)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源及樣本處理 2016年，山東某雞場(chǎng)疑似發(fā)生禽腺病毒感染，發(fā)病雞剖檢表現(xiàn)為嚴(yán)重的心包積液，呈透明的淡黃色或淺褐色，肝臟腫大、變脆、出血或壞死，采集其肝、脾等組織。將從剖檢見(jiàn)肝臟病變壞死病雞中采集的肝臟組織3～4 g，按肝臟組織(g)∶PBS(mL)為1∶5的比例加入無(wú)菌PBS，放入勻漿器中，經(jīng)-80 ℃反復(fù)凍融3次，4 ℃ 12000 r/min離心5 min，收取上清，用0.22 μm的細(xì)菌濾器過(guò)濾，分裝于1.5 mL離心管中備用。

1.2 PCR檢測(cè)與測(cè)序 提取病料樣本的DNA，用針對(duì)FAdV的Hexon基因ORF設(shè)計(jì)如下特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物P1：5′-GAGATGGTGACGGAGGTG′-3′；下游引物P2：5′-AAGCGGTGACGAGGATGC-3′，目的片段大小為3139 bp。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，對(duì)PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與表1中FAdV的12種血清型參考毒株序列進(jìn)行同源性比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析。

表1 FAdV的12種血清型參考毒株信息Tab 1 Information of 12 serotypes of reference strains of FAdV

1.3 病毒分離純化與鑒定 將1.1制備的樣品按5%的劑量，接種長(zhǎng)滿(mǎn)單層的LMH細(xì)胞，吸附1 h后，補(bǔ)充含1%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察，72 h收獲。反復(fù)凍融3次后離心收獲上清，作100倍稀釋后，取1 mL上清加入0.5 mL氯仿，于4 ℃搖床中振搖1 h，12000 r/min離心20 min，輕輕取出離心管，吸取上層液體0.5 mL，于生物安全柜中開(kāi)口放置30 min(用于揮發(fā)殘留的氯仿)備用。處理好的病毒液，再進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)?0-2、10-3、10-43個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種2孔長(zhǎng)滿(mǎn)單層的LMH細(xì)胞板，0.1 mL/孔，吸附1 h，棄去上清，1%瓊脂糖覆蓋后，倒置培養(yǎng)72 h。倒置顯微鏡下觀察，在出現(xiàn)細(xì)胞病變的最高稀釋度孔中，選取單個(gè)細(xì)胞病變斑3個(gè)，每個(gè)斑無(wú)菌挑取至1 mL DMEM中，凍融3次后，離心取上清進(jìn)行10 倍、100 倍稀釋?zhuān)瑢⒃丁?0 倍、100 倍稀釋的病毒液按前述方法進(jìn)行繼續(xù)克隆，上一代克隆獲得的每個(gè)克隆后續(xù)克隆挑取1個(gè)克隆，共克隆3代。最后1代每個(gè)克隆分別接種1個(gè)25 cm2的LMH細(xì)胞瓶，待細(xì)胞病變達(dá)70%以上后置-70 ℃以下保存，為C0代。純化獲得的克隆病毒按1.2方法進(jìn)行Hexon PCR擴(kuò)增，測(cè)序分析。

1.4 種子批的建立與檢定 將FAdV-GY株C0代毒接種2個(gè)長(zhǎng)滿(mǎn)LMH單層的175 cm2細(xì)胞瓶中，每個(gè)接種1 mL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)80%以上后-70 ℃以下保存，為FAdV-GY株 C1代。收獲的病毒按《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行病毒含量測(cè)定、無(wú)菌檢驗(yàn)和支原體檢驗(yàn)。用制備的病毒液制備成滅活疫苗第一次免疫，皮下注射免疫3 周齡SPF雞20 只，0.3 mL/只。21 d后，將制備的病毒液10倍稀釋進(jìn)行第二次免疫，每只雞點(diǎn)眼、滴鼻各1 滴，加肌肉注射三種途徑共0.5 mL。第二次免疫21 d后按第二次免疫的方法進(jìn)行第三次免疫，第三次免疫后21 d翅靜脈采血分離血清，按《中國(guó)獸藥典》附錄3305外源病毒檢驗(yàn)中雞檢查法進(jìn)行抗體檢測(cè)(表2)，以確定是否存在其他外源病毒。

表2 外源病毒檢測(cè)種類(lèi)及檢測(cè)方法Tab 2 Methods of exogenous virus detection

1.5 GY株致病性研究 將FAdV-GY株 C1代毒種用滅菌生理鹽水分別稀釋至病毒含量為： 106.0TCID50/0.1mL、105.0TCID50/0.1mL、104.0TCID50/0.1mL、103.0TCID50/0.1mL共4個(gè)病毒含量梯度，每個(gè)病毒含量梯度經(jīng)胸部肌肉接種4、8周齡SPF雞各5只，每只0.5 mL，同時(shí)4、8 周齡SPF雞分別設(shè)生理鹽水接種對(duì)照5只。攻毒后觀察14 d，詳細(xì)記錄接種雞的發(fā)病和死亡情況，死亡雞立即進(jìn)行剖檢，觀察到期后未死亡雞處死剖檢，以判定不同攻毒劑量對(duì)不同周齡SPF雞的致病性。取GY株C1代病毒液，稀釋至105.0TCID50/0.1mL，胸部肌肉注射和皮下注射兩種途徑分別接種8周齡SPF雞，每只0.5 mL，每組5只，同時(shí)設(shè)5只不接種作為對(duì)照，攻毒后觀察14 d，詳細(xì)記錄接種雞的發(fā)病和死亡情況，死亡雞立即進(jìn)行剖檢，觀察到期后未死亡雞進(jìn)行處死剖檢，以判定不同攻毒途徑對(duì)SPF雞的致病性。另將GY株C1代病毒液，稀釋至105.0TCID50/0.1mL，經(jīng)胸部肌肉接種SPF雞20 只，每只0.5 mL，平均分2組，同時(shí)設(shè)同日齡SPF雞10只不攻毒作為對(duì)照。攻毒后1組觀察7 d，另一組觀察14 d，詳細(xì)記錄接種雞的發(fā)病和死亡情況，死亡雞立即進(jìn)行剖檢，觀察到期后將未死亡雞處死剖檢，觀察發(fā)病規(guī)律和剖檢病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離病毒的PCR檢測(cè)和測(cè)序結(jié)果 針對(duì)FAdV的Hexon基因特異性引物對(duì)病料樣品提取核酸進(jìn)行PCR檢測(cè)，可擴(kuò)增出約3139 bp大小的預(yù)期目的片段(圖1)，初步判斷分離物中含有FAdV。PCR回收產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與表1所列12個(gè)血清型代表毒株Hexon序列比對(duì)結(jié)果表明，分離病毒與FAdV血清4型的同源性最高，達(dá)98.7%，與同一基因型的血清10型序列同源性次之為97.4%，與其他基因型代表毒株的同源性為67.9%～76.8%，與血清4型處于同一個(gè)分支(圖2)，初步判定臨床分離病毒為I群FAdV基因C型，血清4型。

圖2 FAdV不同血清型參考毒株hexon基因遺傳進(jìn)化分析Fig 2 Genetic evolution analysis of Hexon gene of different serumtypes reference strains of FAdV

2.2 病毒的分離純化與鑒定 處理后的樣品接種LMH細(xì)胞后第一代即觀察到明顯的細(xì)胞病變，約在接種后48 h后開(kāi)始出現(xiàn)疑似細(xì)胞病變，72 h后細(xì)胞病變明顯。第一代培養(yǎng)物按10%劑量接種第二代后36 h 80%以上細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、脫落、聚集成團(tuán)、細(xì)胞破損(圖3)。收獲病毒液置于-70 ℃以下保存。

A: 正常的LMH細(xì)胞對(duì)照；B: 感染GY株的LMH細(xì)胞A: Normal LMH cell control; B: LMH cells infected by GY strain圖3 分離病毒在LMH細(xì)胞上導(dǎo)致的細(xì)胞病變Fig 3 Cytopathic effect of isolated virus on LMH cells

氯仿處理后的病毒液經(jīng)3代瓊脂覆蓋篩選蝕斑，獲得3個(gè)克隆株病毒，分別命名為FAdV-GY株C0-1、FAdV-GY株C0-2和FAdV-GY株C0-3。純化獲得的三株病毒Hexon基因PCR擴(kuò)增結(jié)果一致，均出現(xiàn)約3139 bp左右特異條帶(圖4)，PCR測(cè)序結(jié)果與2.1初步分離鑒定序列同源性為100%，初步說(shuō)明克隆獲得的3個(gè)克隆株為同一株病毒。將FAdV-GY株C0-1克隆株病毒接種2個(gè)175 cm2的LMH單層，收獲150 mL病毒液，標(biāo)記為FAdV-GY株C1代，收獲病毒的病毒含量測(cè)定結(jié)果為107.5TCID50/0.1 mL，表明實(shí)驗(yàn)室分離到的FAdV-GY株病毒能適應(yīng)LMH細(xì)胞。純凈性檢驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)AdV-GY株C1代病毒液無(wú)細(xì)菌、霉菌及支原體污染。按《中國(guó)獸藥典》雞檢查法對(duì)FAdV-GY株C1代病毒液進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)，結(jié)果顯示接種SPF雞檢測(cè)抗體除禽腺病毒抗體陽(yáng)性外，其它病原抗體的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明FAdV-GY株C1代病毒無(wú)外源病毒污染。

M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL5000；1：FAdV-GY株C0-1；2：FAdV-GY株C0-2；3：FAdV-GY株C0-3；4：陰性對(duì)照M: Marker DL5000; 1: FAdV-GY C0-1; 2: FAdV-GY C0-2;3: FAdV-GY C0-3; 4: Negative control圖4 不同克隆株病毒PCR檢測(cè)結(jié)果Fig 4 PCR detection results of different cloned viruses

2.3 不同攻毒劑量對(duì)不同周齡SPF雞的致病性 用不同劑量的GY株C1代病毒液分別經(jīng)胸部肌肉接種4周齡和8周齡SPF雞，攻毒后觀察14 d。試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同周齡SPF雞攻擊5×103.0TCID50/0.1mL 及以上的GY株病毒液后引起不同程度的感染和死亡，攻擊5×104.0TCID50/0.1mL的GY株病毒液可以引起5/5發(fā)病，死亡率不低于4/5。發(fā)病雞主要表現(xiàn)為精神不振、不愿行走、羽毛蓬松、嗜睡等；死亡雞剖檢主要表現(xiàn)為心包積液、肝臟出血或壞死；有臨床癥狀未死亡雞剖檢病變不明顯，部分雞出血心包少量積液或心包膜輕度渾濁；未出現(xiàn)臨床癥狀雞剖檢無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。對(duì)照雞均無(wú)臨床癥狀和剖檢病變。結(jié)果見(jiàn)表3、圖5、圖6。

表3 GY株不同攻毒劑量對(duì)4周齡和8周齡SPF雞的致病性研究結(jié)果Tab 3 Pathogenicity of different challenge doses of GY strains on 4 weeks and 8 weeks SPF chickens

A: 攻毒后50 h死亡雞；B: 攻毒后72 h死亡雞；C: 發(fā)病但未死亡雞；D: 對(duì)照雞A: Dead chickens 50 h after challenge; B: Dead chickens 72 h after challenge;C: Chickens with disease but not death; D: Control chickens圖5 4周齡SPF雞攻毒剖檢照片F(xiàn)ig 5 Profile of challenged SPF chickens aged 4 weeks

A: 攻毒后72 h死亡雞；B: 攻毒后97 h死亡雞；C: 攻毒后120 h死亡雞；D: 對(duì)照雞A: Dead chickens 72 h after challenge; B: Dead chickens 97 h after challenge;C: Dead chickens 120 h after challenge; D: Control chickens圖6 8周齡SPF雞攻毒剖檢照片F(xiàn)ig 6 Profile of challenged SPF chickens aged 8 weeks

2.4 不同攻毒途徑對(duì)SPF雞的致病性 取GY株C1代病毒液分別經(jīng)胸部肌肉注射和皮下注射兩種途徑接種8周齡SPF雞，每只0.5 mL(含5×105.0TCID50)，攻毒后觀察14日。結(jié)果顯示，肌肉注射途徑SPF雞發(fā)病率為5/5，死亡率為5/5；皮下注射途徑發(fā)病率為4/5，死亡率4/5。肌肉注射途徑 SPF雞的死亡時(shí)間為攻毒后2～4日，比皮下注射途徑的死亡時(shí)間(3～5日)略早，對(duì)照雞5/5正常。

2.5 發(fā)病規(guī)律和剖檢病變研究 GY株C1代病毒液經(jīng)胸部肌肉攻擊8周齡SPF雞。臨床觀察結(jié)果顯示，攻毒后2～3日開(kāi)始表現(xiàn)臨床癥狀，主要表現(xiàn)為精神沉郁、羽毛蓬亂、不愿走動(dòng)、閉眼嗜睡等，發(fā)病率達(dá)20/20。攻毒后24 h開(kāi)始發(fā)現(xiàn)攻毒雞出現(xiàn)臨床癥狀，死亡集中在3～5日，死亡雞嚴(yán)重心包積液，肝臟有腫大、出血或壞死。攻毒后觀察7日和14日組，死亡率均為9/10。觀察7日組未死亡雞剖檢心包有明顯積液，肝臟有明顯壞死灶；觀察14日組未死亡雞臨床癥狀減輕至消失，剖檢心包未見(jiàn)積液，但心包有輕度渾濁，肝臟未見(jiàn)明顯病變(圖7)。

A 攻毒后7 d未死亡雞；B 攻毒后14 d未死亡雞A: Dead chickens 7 days after challenge; B: Dead chickens 14 days after challenge圖7 8周齡SPF雞攻毒剖檢照片F(xiàn)ig 7 Profile of challenged SPF chickens aged 8 weeks

3 討論與結(jié)論

FAdV是全世界家禽和野禽常見(jiàn)的垂直傳播性病毒之一，自1987年，巴基斯坦首次報(bào)道心包積液綜合征后[6]，美國(guó)等多個(gè)國(guó)家也相繼出現(xiàn)該病的報(bào)道[7]。在我國(guó)雞心包積液-肝炎綜合征的臨床病例中，血清4型最為流行。本研究在2016年也從山東某疑似感染雞群中經(jīng)LMH細(xì)胞分離鑒定到一株血清4型的FAdV并定名為GY株，以期在充分觀察其致病性基礎(chǔ)上探索其作為標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株的可能性。

FAdV的血清型眾多，不同的血清型致病性不同，因此對(duì)血清型的分離鑒定及致病性的研究顯得尤為重要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核苷酸序列測(cè)定與比對(duì)已被廣泛應(yīng)用于FAdV的檢測(cè)與分型[7,8]。Hexon蛋白是FAdV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，通過(guò)對(duì)Hexon基因進(jìn)行測(cè)序與遺傳進(jìn)化比對(duì)，可準(zhǔn)確區(qū)分FAdV不同的血清型[9]，因此常被作為FAdV基因分型的靶基因[10-11]。本研究在接種LMH細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)該毒株的Hexon基因進(jìn)行同源性比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)該株病毒與其他血清4型參考株屬于同一分支，確定分離的毒株屬于血清4型FAdV。

許多FAdV可在健康禽體內(nèi)復(fù)制，癥狀非常輕微或不出現(xiàn)感染癥狀，但有一些因素，特別是與其它病原并發(fā)感染時(shí)，F(xiàn)AdV可作為繼發(fā)病原引起雞群發(fā)病和死亡。特別是與雞傳染性貧血病毒等免疫抑制病毒發(fā)生混合感染后可增強(qiáng)FAdV的毒力，如有研究表明，在使用含有FAdV和CIAV共污染的新城疫疫苗后，CIAV能協(xié)助FAdV破壞母源抗體的保護(hù)作用，引起機(jī)體發(fā)病，而單污染則不會(huì)引起明顯癥狀[12-13]。這提示我們，要客觀評(píng)價(jià)FAdV的致病性，首先需要確保其純凈性。為此，本研究首先經(jīng)3代瓊脂覆蓋篩選蝕斑，獲得3個(gè)FAdV-GY株克隆株病毒，純化獲得的FAdV-GY株C0-1、FAdV-GY株C0-2、FAdV-GY株C0-3病毒Hexon基因PCR擴(kuò)增結(jié)果一致，均出現(xiàn)約3139 bp左右特異條帶，初步證實(shí)純化的毒株具有較好的特異性。不僅如此，本研究還嚴(yán)格按《中國(guó)獸藥典》雞檢查法對(duì)C1代FAdV-GY株病毒液進(jìn)行了針對(duì)多達(dá)17種外源病毒的檢驗(yàn)，證實(shí)FAdV-GY株C1代病毒無(wú)外源病毒污染，建立了純凈度高的FAdV-GY株種子批。

開(kāi)發(fā)安全有效的疫苗是防控FAdV感染的當(dāng)務(wù)之急，對(duì)此國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有大量的研究報(bào)道[14-16]，而評(píng)價(jià)疫苗是否有效的關(guān)鍵因素之一是需要有經(jīng)過(guò)毒力驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)用強(qiáng)毒株。近期，已有多個(gè)報(bào)道對(duì)血清4型的FAdV致病性和發(fā)病規(guī)律開(kāi)展了觀察[17-19]。本研究則利用經(jīng)過(guò)純化和外源病毒檢測(cè)的FAdV-GY株C1代種子批對(duì)其致病性開(kāi)展了系統(tǒng)研究，特別是從不同感染途徑和不同感染劑量等方面進(jìn)行了相對(duì)全面的觀察。結(jié)果證實(shí)，經(jīng)胸部肌肉注射后發(fā)病率和發(fā)病時(shí)間相對(duì)于頸部皮下注射途徑更有優(yōu)勢(shì)，確定將攻毒途徑定為肌肉注射。在四個(gè)不同梯度感染劑量中，以不低于5×104.0的劑量攻毒，可引起100%的4周齡和8周齡SPF雞發(fā)病，80%以上死亡，為確保攻毒試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，將攻毒劑量定為每只雞5×105.0TCID50。在多次實(shí)驗(yàn)中，SPF雞于攻毒后2日開(kāi)始有雞出現(xiàn)精神不振、羽毛蓬亂、不愿走動(dòng)、閉眼嗜睡等臨床癥狀，出現(xiàn)上述癥狀后1～2 d大部分發(fā)病雞死亡，有的試驗(yàn)雞未見(jiàn)明顯的臨床癥狀死亡，死亡雞剖檢均可見(jiàn)心包積液及肝臟腫大、出血或壞死等病變；對(duì)出現(xiàn)臨床癥狀未死亡的雞在攻毒后7日進(jìn)行剖檢，亦可見(jiàn)典型的心包積液及肝臟腫大、出血等病變；出現(xiàn)臨床癥狀未死亡雞觀察至攻毒后14 d，發(fā)病雞臨床癥狀減輕或消失，心包積液及肝臟腫大、出血等病變不明顯，可見(jiàn)攻毒后觀察7 d未死亡雞剖檢病變更明顯。依據(jù)多次攻毒試驗(yàn)臨床觀察和剖檢制定了該強(qiáng)毒株的發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)，即出現(xiàn)任意一項(xiàng)即判為發(fā)?。?1)死亡；(2)雞只出現(xiàn)精神不振、羽毛蓬亂、不愿走動(dòng)、嗜睡等任兩項(xiàng)臨床癥狀；(3)剖檢出現(xiàn)心包積液或肝臟腫大、出血或壞死等病理變化。

本研究完成了FAdV-GY株的分離鑒定、種子批建立、純凈性和致病性的研究，確定FAdV GY株作為攻毒用毒的攻毒途徑、劑量和發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)，成功制備了可用于評(píng)判FAdV相關(guān)生物制品有效性的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株，為FAdV生物制品的研發(fā)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。