一株MDBK細(xì)胞的低血清懸浮馴化研究

王 磊，楊承槐，劉 瑩

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

MDBK細(xì)胞(Madin-Darby Bovine Kidney Cells，MDBK)是由S H Madin和N B Darby于1953年從美國(guó)一頭健康的成年公牛腎臟組織中分離培養(yǎng)建立的貼壁培養(yǎng)型傳代細(xì)胞系[1]。該細(xì)胞系對(duì)多種病原(牛病毒性腹瀉病毒、傳染性牛鼻氣管炎病毒、偽狂犬病毒等)易感[2-3]，被廣泛用于病毒感染、檢測(cè)和培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其用于傳染性牛鼻氣管炎病毒的增殖，病毒感染效率高、增殖快且不易變異，是公認(rèn)的適合生產(chǎn)傳染性牛鼻氣管炎疫苗的細(xì)胞基質(zhì)[4]。但是，以MDBK細(xì)胞作為生產(chǎn)基質(zhì)的相關(guān)疫苗，由于其貼壁生長(zhǎng)特性的限制，多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式和微載體培養(yǎng)方式進(jìn)行生產(chǎn)，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，下游工藝相對(duì)復(fù)雜，工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的難度較大。因此馴化全懸浮的MDBK細(xì)胞具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

懸浮細(xì)胞是指生長(zhǎng)不依賴支持物表面,可在液體培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)的細(xì)胞。與貼壁細(xì)胞相比，懸浮細(xì)胞盡量減少或避免了動(dòng)物源性血清的添加，使其具有更好的傳代穩(wěn)定性和安全性[5]，同時(shí)還具備了可線性放大培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，是實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)器大規(guī)模、高效率生產(chǎn)的前提條件[6-7]。懸浮培養(yǎng)基的使用還徹底擺脫了細(xì)胞貼附基質(zhì)，可以有效地簡(jiǎn)化下游分離純化工藝的難度，節(jié)約設(shè)備空間，縮短生產(chǎn)時(shí)間，降低生產(chǎn)成本[8]。本試驗(yàn)對(duì)一株貼壁的MDBK細(xì)胞進(jìn)行了全懸浮馴化研究，以期為相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的升級(jí)改進(jìn)提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和毒株 MDBK細(xì)胞(第9代，批號(hào)20170623)、偽狂犬病毒(Bartha-K61株)、傳染性牛鼻氣管炎病毒(AV21株)由國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種中心鑒定保藏。

1.1.2 主要試劑和耗材 DMEM(Gibco，批號(hào)8119416)、0.25%胰蛋白酶(Gibco，批號(hào)1953147)、懸浮培養(yǎng)基(MDBK-SLM)、胎牛血清(PAN，批號(hào)ST170802)、臺(tái)盼藍(lán)染液(sigma，批號(hào)RNBG9718)。

1.1.3 主要儀器 Hettich離心機(jī)(型號(hào)320R)、Thermo CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)Heracell 240i)、Nikon倒置顯微鏡(型號(hào)TS100)、Biomedical多通道生化分析儀(型號(hào) NOVA400)、infors振蕩型CO2培養(yǎng)箱(型號(hào) Minitron)、Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(型號(hào)Auto T4)。

1.2 方法

1.2.1 貼壁MDBK細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中懸浮馴化培養(yǎng) 取培養(yǎng)成良好單層的MDBK細(xì)胞，消化后收集細(xì)胞培養(yǎng)物懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，1000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀按照初始密度1×106/mL用40 mL低血清培養(yǎng)基(含2%胎牛血清)重懸，置于125 mL三角搖瓶中，110 r/min、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。每24 h取樣計(jì)數(shù)，培養(yǎng)至48 h處理，若48 h細(xì)胞密度高于2×106/mL，使用含2%胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至1×106/mL，若48 h細(xì)胞密度低于2.0×106/mL，1000 r/min離心10 min后，更換新鮮培養(yǎng)基，直至每48 h可以正常稀釋傳代，連續(xù)5代保持48 h的細(xì)胞密度是初始密度的兩倍以上，且細(xì)胞活率高于90%，可以認(rèn)為馴化成功。待細(xì)胞在含2%胎牛血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)穩(wěn)定后，采用上述方法逐級(jí)降低培養(yǎng)基中血清用量(1%、0.5%胎牛血清含量)。降血清過(guò)程中細(xì)胞密度穩(wěn)定5代以上方可進(jìn)行下一步降血清適應(yīng)。

1.2.2 懸浮細(xì)胞的批培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線繪制及代謝物含量測(cè)定 細(xì)胞密度測(cè)定方法采用臺(tái)盼藍(lán)(TB) 染色法，具體操作如下：取200 μL細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染液等體積稀釋細(xì)胞懸液后，吹打均勻，取20 μL加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，放入Countstar 細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品取4個(gè)視野計(jì)數(shù)，結(jié)果求平均值，計(jì)算細(xì)胞密度。

將懸浮細(xì)胞按1×106/mL的初始密度接種40 mL培養(yǎng)基后置于125 mL三角搖瓶中，110 r/min、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。在傳代后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h分別測(cè)定細(xì)胞密度并繪制生長(zhǎng)曲線。在計(jì)數(shù)期間，同時(shí)每24 h取1 mL細(xì)胞懸液，3000 r/min離心10 min，吸取培養(yǎng)基上清液，使用NOVA 400多通道生化分析儀測(cè)定葡萄糖、乳酸、NH4+、谷氨酰胺的含量。

1.2.3 倍增時(shí)間的測(cè)定 取馴化傳代穩(wěn)定的細(xì)胞，每天取樣計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。取馴化傳代穩(wěn)定細(xì)胞峰值前一天的細(xì)胞計(jì)數(shù)(Y)、接種細(xì)胞數(shù)(X)及生長(zhǎng)時(shí)間(T)計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間Δt，計(jì)算公式為:Δt=T/A；A= log2Y/X

1.2.4 細(xì)胞傳代穩(wěn)定性測(cè)定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮MDBK細(xì)胞按1×106/mL的初始密度接種40 mL培養(yǎng)基后，置于125 mL三角搖瓶中，110 r/min、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。每48 h傳代一次，即用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞液稀釋至1×106/mL。將細(xì)胞進(jìn)行22 d的連續(xù)傳代培養(yǎng)，對(duì)比每次傳代時(shí)的細(xì)胞密度和細(xì)胞活率的差異。

1.2.5 病毒增殖實(shí)驗(yàn) 取低血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的懸浮MDBK細(xì)胞，離心后按2×106/mL細(xì)胞密度接種至三角搖瓶，每瓶40 mL細(xì)胞懸液。同時(shí)按體積比的1%分別接入偽狂犬病毒和傳染性牛鼻氣管炎病毒。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h分別收獲病毒并測(cè)定病毒滴度，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和貼壁細(xì)胞接毒對(duì)照。

用DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基將待檢病毒液在滅菌管作1∶10系列稀釋，取10-4～10-74個(gè)稀釋度病毒液，分別接種已在96孔板中生長(zhǎng)良好的檢驗(yàn)用細(xì)胞(貼壁生長(zhǎng)的MDBK細(xì)胞)，每個(gè)稀釋度6個(gè)孔，100 μL/孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。37 ℃、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)96 h，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

2 結(jié)果與分析

2.1 貼壁MDBK細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中懸浮馴化培養(yǎng) 結(jié)果見(jiàn)表1。MDBK細(xì)胞在貼壁狀態(tài)至2%血清全懸浮階段時(shí)，細(xì)胞容易受到血清的影響從而發(fā)生結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。采用細(xì)胞沉降的辦法，自然沉降2～4 min后盡可能吸取上層細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到等體積的新鮮培養(yǎng)基中。經(jīng)過(guò)8代左右，MDBK細(xì)胞逐漸可以適應(yīng)2%血清的全懸浮培養(yǎng)。再連續(xù)傳7代，保證每代在48 h的細(xì)胞密度是初始密度的兩倍，細(xì)胞活率穩(wěn)定在90%以上，可以認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)初步適應(yīng)了懸浮培養(yǎng)條件。

表1 貼壁MDBK細(xì)胞全懸浮馴化情況Tab 1 Acclimation of adherent MDBK cells in complete suspension

隨著細(xì)胞對(duì)低血清的逐步適應(yīng)，進(jìn)一步降低血清可以有效改善細(xì)胞的結(jié)團(tuán)問(wèn)題(圖1)，同時(shí)顯著提高了生長(zhǎng)能力，即在0.5%血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d細(xì)胞密度最高可達(dá)1.16×107/mL。經(jīng)過(guò)35代左右的馴化，得到了一株可以在0.5%血清培養(yǎng)基中全懸浮生長(zhǎng)的形態(tài)均一、分散均勻、生長(zhǎng)密度穩(wěn)定的MDBK細(xì)胞(以下稱MDBK-0.5%FBS細(xì)胞)。

A:貼壁MDBK細(xì)胞形態(tài)；B:MDBK細(xì)胞在2%血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)72 h形態(tài)；C:MDBK細(xì)胞在1%血清懸浮培養(yǎng)72 h形態(tài)；D:MDBK細(xì)胞在0.5%血清懸浮培養(yǎng)72 h形態(tài)A:Morphology of adherent MDBK cells; B: MDBK cells cultured in 2% serum medium for 72 h; C: MDBK cells cultured in 1% serum medium for 72 h; D: MDBK cells cultured in 0.5% serum medium for 72 h圖1 MDBK細(xì)胞在不同血清濃度培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)狀態(tài)Fig 1 Suspension culture of MDBK cells in different serum concentrations mediums

2.2 在不同血清濃度中馴化的MDBK細(xì)胞的批生長(zhǎng)曲線與倍增時(shí)間測(cè)定結(jié)果 在不同血清濃度中馴化的MDBK細(xì)胞在有限營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中批培養(yǎng)情況存在明顯差異(圖2)。在2%血清中懸浮適應(yīng)的MDBK細(xì)胞培養(yǎng)5 d時(shí)最大細(xì)胞密度達(dá)到7.08×106/mL，倍增時(shí)間為32.33 h；在1%血清中懸浮適應(yīng)的MDBK細(xì)胞5 d時(shí)最大細(xì)胞密度達(dá)到7.64×106/mL，倍增時(shí)間為30.15 h；在0.5%血清中懸浮適應(yīng)的MDBK細(xì)胞3 d時(shí)最大細(xì)胞密度達(dá)到11.6×106/mL，倍增時(shí)間為17.32 h。

2.3 MDBK-0.5%FBS細(xì)胞批培養(yǎng)過(guò)程中代謝物的含量變化 為考察MDBK-0.5%FBS細(xì)胞在有限營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中的代謝物變化情況，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×106/mL初始密度進(jìn)行為期 6 d的批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，定時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖、乳酸、NH4+、谷氨酰胺的含量變化(圖2、圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初始的1～2 d細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期快速增長(zhǎng)，同時(shí)葡萄糖作為重要的碳來(lái)源被快速消耗；第3天后，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖量快消耗殆盡，同時(shí)產(chǎn)生大量的NH4+、乳酸等副代謝產(chǎn)物時(shí)，細(xì)胞停止增殖，生長(zhǎng)密度達(dá)到了最大值。

2.4 MDBK-0.5% FBS細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性測(cè)定為研究MDBK-0.5% FBS懸浮細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮MDBK細(xì)胞以1×106/mL的初始密度連續(xù)傳代，在多次傳代過(guò)程中，各個(gè)代次的細(xì)胞密度均維持在穩(wěn)定水平(48 h后細(xì)胞密度≥5×106/mL)，細(xì)胞活率保持在93%以上(圖4)。

圖2 不同血清濃度培養(yǎng)基中MDBK細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)的批生長(zhǎng)曲線Fig 2 Batch growth curve of MDBK cells in different serum concentrations mediums

圖3 MDBK-0.5%FBS細(xì)胞批培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基葡萄糖、乳酸、NH4+、谷氨酰胺的含量變化Fig 3 Changes of glucose, lactic acid, NH4+, glutamine in MDBK-0.5%FBS batch culture

圖4 MDBK細(xì)胞在0.5%血清懸浮培養(yǎng)基中傳代密度以及細(xì)胞活率Fig 4 Passage density and cell viability of MDBK cells in 0.5% serum suspension medium

2.5 MDBK-0.5%FBS細(xì)胞對(duì)偽狂犬病毒和傳染性牛鼻氣管炎病毒的敏感性測(cè)定 MDBK-0.5%FBS細(xì)胞分別接種偽狂犬病毒和傳染性牛鼻氣管炎病毒后，24 h均發(fā)生了皺縮，72 h大部分細(xì)胞死亡。傳染性牛鼻氣管炎病毒滴度在24 h達(dá)到最高，為107.6TCID50/mL；偽狂犬病毒滴度在48 h達(dá)到最高，為107.6TCID50/mL(表2)。兩種病毒分別接種貼壁對(duì)照細(xì)胞后每24 h觀察一次，傳染性牛鼻氣管炎病毒接毒后24 h開(kāi)始出現(xiàn)病變，48 h全部脫落；偽狂犬病毒接毒后24 h開(kāi)始出現(xiàn)病變，72 h全部脫落。

表2 MDBK-0.5%FBS細(xì)胞增殖傳染性牛鼻氣管炎病毒和偽狂犬病毒結(jié)果Tab 2 Result of infectious IBRV and PRV in MDBK-0.5% FBS cells

3 討論與結(jié)論

利用全懸浮的細(xì)胞系作為疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)，不僅可以實(shí)現(xiàn)在疫病爆發(fā)初期短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模應(yīng)急生產(chǎn)的需要，還盡可能規(guī)避了大量使用動(dòng)物源性血清所帶來(lái)不確定性外源因子的風(fēng)險(xiǎn)[9]。

細(xì)胞的懸浮馴化關(guān)鍵點(diǎn)在于懸浮培養(yǎng)基種類以及馴化過(guò)程中策略的選擇。低血清或無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基中通常使用酵母水解物配合成分明確的動(dòng)物源生長(zhǎng)因子來(lái)代替動(dòng)物源性血清的營(yíng)養(yǎng)作用[10]。糖類是細(xì)胞利用的重要能量和碳源，也是維持細(xì)胞生長(zhǎng)重要能量供給。谷氨酰胺作為培養(yǎng)基添加劑可以有效地促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體的產(chǎn)生[11]。針對(duì)不同細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝特性選擇合適的培養(yǎng)基顯得尤為重要[12]。理想的懸浮培養(yǎng)基，可以使細(xì)胞有效利用葡萄糖，支持細(xì)胞的快速增長(zhǎng)，同時(shí)延遲乳酸以及NH4+等副產(chǎn)物的積累，從而達(dá)到細(xì)胞高密度培養(yǎng)的目標(biāo)。反之會(huì)使細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)培養(yǎng)基中的糖類物質(zhì)利用率偏低，使乳酸、NH4+等代謝副產(chǎn)物的量快速積累，細(xì)胞過(guò)早地進(jìn)入生長(zhǎng)維持期，同時(shí)產(chǎn)生大量的細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，無(wú)法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。

在細(xì)胞的懸浮馴化過(guò)程中一般采用將消化的細(xì)胞直接接入低血清/無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基馴化，或者在貼壁或懸浮狀態(tài)下逐級(jí)替換原有培養(yǎng)基并降低血清的懸浮馴化方法[13]。逐級(jí)替代培養(yǎng)基降低血清的方法要比直接馴化法耗時(shí)多，但是相對(duì)柔和，適用于難以直接馴化的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中MDBK細(xì)胞的懸浮馴化結(jié)合上述兩種方法，采用在低血清懸浮培養(yǎng)基中直接馴化，然后再逐級(jí)降低血清的策略，成功得到了一株可在0.5%血清濃度下懸浮生長(zhǎng)，傳代穩(wěn)定性好，可在三角搖瓶中實(shí)現(xiàn)較高密度生長(zhǎng)，最高密度可達(dá)1.16×107/mL的懸浮細(xì)胞。病毒敏感性實(shí)驗(yàn)表明，雖然MDBK的培養(yǎng)方式發(fā)生了改變，但并沒(méi)有影響細(xì)胞對(duì)特定病毒的增殖特性。