解淀粉芽胞桿菌固態(tài)發(fā)酵當(dāng)歸培養(yǎng)基的研究

朱慶賀，苗 艷，蘭世捷，陳 亮，尹珺伊，黃寶銀，田秋豐，張 紅，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161000)

當(dāng)歸是一種具有補(bǔ)血活血、潤(rùn)腸通便、調(diào)經(jīng)止痛等功效的常用中草藥[1]。其主要活性成分為藁本內(nèi)酯、阿魏酸和當(dāng)歸多糖。在獸醫(yī)臨床中主要用于治療豬、牛、羊的卵巢囊腫和子宮內(nèi)膜炎，效果顯著，也常作為中草料飼料添加劑用于改善動(dòng)物生產(chǎn)繁殖性能[2-4]。然而，當(dāng)歸中雖然含有眾多的藥物活性成分，但存在利用率較低的缺點(diǎn)，尤其在普通方法中藥提取后所剩藥渣中仍有較多活性成分殘留。因此，有必要進(jìn)一步改進(jìn)當(dāng)歸相關(guān)活性成分的利用效率，提高活性物質(zhì)的有效釋放。

微生物發(fā)酵已被廣泛報(bào)道可以有效提高中草藥中主要活性成分的含量，甚至能夠在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生新的活性物質(zhì)[5-6]，這對(duì)于研究和開(kāi)發(fā)新型綠色無(wú)公害飼料添加劑，新型中藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)甚至作為抗生素的替代品具有重要意義。解淀粉芽孢桿菌是一種好氧、易分離培養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)的益生菌，可以提高飼料利用率，改善動(dòng)物腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)。此外，解淀粉芽孢桿菌能夠分泌多種酶類(lèi)物質(zhì)和抑菌活性物質(zhì)，運(yùn)用在中藥發(fā)酵中能夠幫助裂解細(xì)胞壁，從而有利于中藥有效成分的釋放[7-8]，研究利用已分離的一株解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行當(dāng)歸發(fā)酵，并以當(dāng)歸多糖含量為指標(biāo)對(duì)固態(tài)發(fā)酵當(dāng)歸培養(yǎng)基的成分進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，確定了固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分及添加比例。為后期獸用當(dāng)歸發(fā)酵產(chǎn)品的技術(shù)開(kāi)發(fā)及工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 解淀粉芽孢桿菌SSYB株，由本單位微生物研究室分離并保存)；當(dāng)歸粉(過(guò)40目篩)，購(gòu)自齊齊哈爾齊泰醫(yī)藥；蛋白胨，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、蔗糖、尿素等，購(gòu)自齊齊哈爾恒輝化工。

1.2 試驗(yàn)儀器 UV-1900 PC/UV-1901雙束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；MS104TS/02電子天平，梅特勒-托利多(上海) 有限公司。

1.3 種子液的制備 將貯存于-80 ℃的解淀粉芽孢桿菌(SSYB)解凍后劃線(xiàn)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后，從平板中挑取單菌落至5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，170 rpm搖床活化16～18 h后，即制得種子液。

1.4 當(dāng)歸固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分的篩選

1.4.1 碳源篩選 分別以50 g/L玉米粉、50 g/L馬鈴薯淀粉、10 g/L蔗糖、100 g/L當(dāng)歸替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、葡萄糖10 g/L、NaCL 5 g/L、當(dāng)歸粉100 g/L)中的碳源葡萄糖，培養(yǎng)基中其他成分不變。取解淀粉芽胞桿菌種子液，以2%接種量分別接種替代培養(yǎng)基，同時(shí)以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照。均置于37 ℃靜止培養(yǎng)72 h，取樣，按苯酚-硫酸顯色法測(cè)定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.2 氮源篩選 分別以10 g/L 尿素、50 g/ L 黃豆粉、10 g/L (NH4)2SO4和10 g/L NHCl 替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源蛋白胨，培養(yǎng)基中其他成分不變。按照1.4.1中的方法培養(yǎng)、取樣和測(cè)定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.3 無(wú)機(jī)鹽篩選 分別以2 g/L KH2PO4、1.5 g/L碳酸鈣、2 g/L 硫酸鎂(MgSO4·7H2O)和0.2 g/L硫酸錳替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的NaCl，培養(yǎng)基中其他成分不變。按照1.4.1中的方法培養(yǎng)、取樣和測(cè)定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5 當(dāng)歸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析 通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出當(dāng)歸粉、黃豆粉、碳酸鈣和水為當(dāng)歸固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分，采用響應(yīng)面中心組合的方法設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化當(dāng)歸固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中當(dāng)歸粉、黃豆粉、碳酸鈣和水4個(gè)組分的配比量。各因素水平及編碼見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。用軟件Design Expert V 12進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。

1.5.2 模型驗(yàn)證試驗(yàn) 將根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果得到的最優(yōu)化培養(yǎng)基和原始培養(yǎng)基，在相同的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，按1.4.1中的方法培養(yǎng)、取樣和測(cè)定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)。

表1 Box-Behnken Design試驗(yàn)因素和編碼水平Tab 1 Factors and levels for Box-Behnken Design

1.6 固體發(fā)酵當(dāng)歸中多糖含量的測(cè)定

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 選用苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定。精密稱(chēng)取在105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品0.1 g于100 mL的容量瓶中，加水定容至100 mL即得1 mg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液，取1 mg/mL葡萄糖對(duì)照品分別制備為5、10、20、40、60、80、100 μg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液。分別吸取2 mL，加5%的苯酚1 mL，混勻后迅速加5 mL濃硫酸，混勻后沸水中加熱15 min，放置室溫后測(cè)量，以蒸餾水為空白，490 nm測(cè)定吸光度值。

1.6.2 樣品溶液的測(cè)定 取5 g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物加100 mL水震蕩浸泡1 h，離心取上清后加無(wú)水乙醇至乙醇終濃度為75%，室溫靜置24 h后離心收集沉淀加水定容至500 mL，按照1.6.1中苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分的篩選

2.1.1 碳源篩選 試驗(yàn)結(jié)果如圖1-A所示，以當(dāng)歸為碳源的培養(yǎng)基中每克發(fā)酵物中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(24.69 mg/g)，然后依次是葡萄糖(23.08 mg/g)、玉米粉(23.05 mg/g)、馬鈴薯淀粉(22.86 mg/g)，蔗糖(22.56 mg/g)。因以當(dāng)歸粉為碳源進(jìn)行發(fā)酵所得多糖含量最高，且本研究菌株旨在用于發(fā)酵中藥，所以選用當(dāng)歸粉為碳源。

2.1.2 氮源篩選 試驗(yàn)結(jié)果如圖1-B所示，以黃豆粉為氮源的培養(yǎng)基中每克發(fā)酵物中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(24.75 mg/g)，然后依次是蛋白胨(24.45 mg/g)、尿素(22.87 mg/g)、NH4Cl (22.50 m/g)、(NH4)2SO4(22.15 mg/g)，所以選用黃豆粉為氮源。

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽篩選 試驗(yàn)結(jié)果如圖1-C所示，以碳酸鈣為無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中每克發(fā)酵物中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高 (24.88 mg/g)，然后依次是氯化鈉(24.76 mg/g)、硫酸鎂 (24.43 mg/g)、硫酸猛(24.21 mg/g)，KH2PO4最低(24.04 mg/g)，所以選用碳酸鈣為無(wú)機(jī)鹽。

圖1 培養(yǎng)基成分篩選Fig 1 Screening of medium components

2.2 當(dāng)歸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken Design方法設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以多糖含量為響應(yīng)值，以當(dāng)歸(A)、黃豆粉(B)、碳酸鈣(C)和水(D)為四個(gè)考察因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，共計(jì)29組試驗(yàn)，其中Y為每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物中當(dāng)歸多糖的提取量(mg)。

表2 Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab 2 Protocol and result of Box-Behnken Design

2.2.2 數(shù)據(jù)處理 由表3可知，使用軟件Design Expert V 12對(duì)上表中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得回歸方程：Y=24.5+1.18*A+0.7192*B-0.1283*C-0.1058*D+0.2400*AB+0.3300*AC-0.0750*AD+0.2650*BC+0.1375*BD-0.1900*CD-1.58*A2-0.8348*B2-1.18*C2-0.6948*D2。其中，R2=0.9475，說(shuō)明該模型與實(shí)際擬合較好，A2、B2、C2、D2對(duì)Y值影響均極顯著(P<0.001)，其余項(xiàng)影響均不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面分析 由圖2、3可知，通過(guò)Design Expert V 12軟件作響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖，可直觀(guān)地看出各因子對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢(shì)。其中，圖1中A、B兩因素在所設(shè)中心點(diǎn)附近取值時(shí)Y值達(dá)到最大，圖2中C、D兩因素在所設(shè)中心點(diǎn)附近取值時(shí)Y值達(dá)到最大。在本研究水平范圍內(nèi)Y存在最大值，即等高線(xiàn)圖標(biāo)記的中心點(diǎn)。當(dāng)Y 值最大時(shí)，四個(gè)考察因素的濃度通過(guò)所得回歸方程可求解，即：當(dāng)歸320.914 g/L、黃豆粉109.918 g/L、碳酸鈣1.532 g/L、水544.159 mL/L。

圖2 當(dāng)歸粉與黃豆粉交互響應(yīng)面圖及其等高線(xiàn)圖Fig 2 Response surface and contour plots for the effect between angelica and soybean flour

圖3 碳酸鈣與水交互響應(yīng)面圖及其等高線(xiàn)圖Fig 3 Response surface and contour plots for the effect between calcium carbonate and water

2.2.4 模型驗(yàn)證試驗(yàn) 進(jìn)行三次重復(fù)固態(tài)發(fā)酵后，固態(tài)發(fā)酵物中的當(dāng)歸多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24.88、24.91和 24.81 mg/g，平均值為24.87 mg/g，與預(yù)測(cè)值相符。

2.3 固體發(fā)酵當(dāng)歸中多糖含量的測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 由圖4可知，以490 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定各稀釋度的葡萄糖對(duì)照品吸光度，以葡萄糖濃度(μg/mL)為x軸，吸光值為 y軸進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：y=0.0134x-0.0417，R2=0.9956。結(jié)果表明，在 5 μg/mL～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig 4 Glucose standard curve

2.3.2 樣品溶液的測(cè)定 按照1.6.1中苯酚-硫酸法對(duì)樣品進(jìn)行吸光度測(cè)定，然后通過(guò)所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程求得所測(cè)樣品中葡萄糖濃度，結(jié)果見(jiàn)表2，其中的Y值即為每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物中當(dāng)歸多糖的提取量(mg)。

3 討論與結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶特性，可以合成多種纖維素酶，具有促進(jìn)木質(zhì)纖維素分解的能力[10]。纖維素酶能夠促進(jìn)多種中藥中有效成分釋放，從而提高中藥的提取率[7]。侯美如等利用解淀粉芽胞桿菌對(duì)中藥黃芪進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果顯示，利用解淀粉芽胞桿菌固態(tài)發(fā)酵黃芪可顯著提高黃芪各種有效成分的含量。從而提高了黃芪的利用率[9]。研究應(yīng)用本研究室所分離篩選到的一株產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽胞桿菌(SSYB)發(fā)酵當(dāng)歸，旨在為研發(fā)當(dāng)歸發(fā)酵中藥奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

表3 二次回歸模型方差分析結(jié)果Tab 3 ANOVA results of factors for the quadratic regression model

當(dāng)歸的主要活性成分為當(dāng)歸多糖，一般采用粗提、精提等多種分離技術(shù)，主要形式包括利用熱水浸提法、微波萃取技術(shù)法、超聲萃取法以及水煮醇沉法等進(jìn)行提取[1]，本研究根據(jù)得量對(duì)比以及技術(shù)條件要求選擇超聲法進(jìn)行了當(dāng)歸多糖的提取，結(jié)果表明，無(wú)論發(fā)酵前或是發(fā)酵后都能有效提取當(dāng)歸多糖，而且在經(jīng)過(guò)篩選和優(yōu)化后，發(fā)酵后的當(dāng)歸多糖得量質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到24.91 mg/g，即發(fā)酵后的當(dāng)歸多糖含量達(dá)到了發(fā)酵前當(dāng)歸多糖的149.70%。發(fā)酵后當(dāng)歸多糖增加了接近50%。證明解密芽孢桿菌發(fā)酵能夠顯著增當(dāng)歸中有效物質(zhì)當(dāng)歸多糖的含量。

另外，目前用于發(fā)酵當(dāng)歸的菌種主要是靈芝菌，魏龍以當(dāng)歸為藥性基質(zhì)，靈芝為發(fā)酵菌種進(jìn)行了雙向發(fā)酵，確定靈芝-當(dāng)歸雙向發(fā)酵菌質(zhì)具有良好的抗氧化活性，且較發(fā)酵前具有顯著提高[5]，但該發(fā)酵方式時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)pH和料層厚度都有一定要求，這就大大增加了時(shí)間成本、勞動(dòng)成本和發(fā)酵難度。目前報(bào)道有將解淀粉芽胞桿菌用于中藥黃芪發(fā)酵的報(bào)道，但尚未有用于當(dāng)歸發(fā)酵的報(bào)道。本研究選用在實(shí)際產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中可實(shí)現(xiàn)的條件對(duì)當(dāng)歸進(jìn)行發(fā)酵，所用培養(yǎng)基組分常見(jiàn)，所用發(fā)酵條件和方法簡(jiǎn)單易操作，更易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，有廣闊的應(yīng)用前景。

研究根據(jù)解淀粉芽胞桿菌分離株的生物學(xué)特性以及研發(fā)目的，以當(dāng)歸粉、玉米粉、黃豆粉、尿素、碳酸鈣、氯化鈉等原材料為對(duì)象，采用單因素試驗(yàn)篩選擬用于當(dāng)歸產(chǎn)業(yè)化固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基組分，結(jié)果表明，當(dāng)歸粉、黃豆粉、碳酸鈣和水是有利于當(dāng)歸發(fā)酵的高效成分。采用Box-Behnken Design試驗(yàn)優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分為當(dāng)歸320.914 g/L、黃豆粉109.918 g/L、碳酸鈣1.532 g/L、水544.159 mL/L，表明在上述成分比例條件下，當(dāng)歸能夠被最優(yōu)發(fā)酵。