ST細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)的馴化及其培養(yǎng)偽狂犬病毒的工藝研究

漆世華，韓 興，秦紅剛，李晶梅，熊 亮，秦 偉，謝紅玲，鄭良益，石寶蘭，馮 釗，徐新星

(國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司，武漢 430075)

偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的一種重要傳染病[1]。其中豬偽狂犬病在我國普遍流行，疫苗接種是預(yù)防和控制該病的有效手段。目前均采用轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗[2]，勞動強(qiáng)度大，生產(chǎn)效率低。生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)工藝具有生產(chǎn)效率高、操作簡單、可自動化控制等優(yōu)點，正在成為當(dāng)前生物制品研發(fā)生產(chǎn)的主流技術(shù)[3]。

ST細(xì)胞為豬睪丸傳代細(xì)胞系，對多種病毒敏感，如豬瘟病毒(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和偽狂犬病毒(PRV)等，已經(jīng)應(yīng)用于豬瘟疫苗的生產(chǎn)[4]。但ST細(xì)胞是貼壁依賴性細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)需要采用微載體懸浮技術(shù)[5]，工業(yè)化放大受到了其貼壁性能的限制，操作繁瑣。為利用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病疫苗，本研究馴化建立了全懸浮培養(yǎng)的ST細(xì)胞系，并優(yōu)化了全懸浮培養(yǎng)的ST細(xì)胞培養(yǎng)偽狂犬病毒的工藝參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、病毒和培養(yǎng)基 ST細(xì)胞、偽狂犬病毒C株為國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司保存；DMEM/F12培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品；STP無血清培養(yǎng)基為深圳壹生科生物科技公司的產(chǎn)品；新生牛血清為內(nèi)蒙古金源康公司產(chǎn)品。

1.2 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑 Siat7e基因真核表達(dá)質(zhì)粒為Genecopoeia公司產(chǎn)品，貨號:EX-V1581-M98；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000和G418為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器設(shè)備 搖床為美國精騏公司產(chǎn)品；7 L、50 L生物反應(yīng)器,購于廣州齊志生物工程設(shè)備有限公司。

1.4 ST細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)的馴化

1.4.1 表達(dá)Siat7e基因的穩(wěn)定ST細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染與篩選 從液氮罐中取出凍存的ST細(xì)胞，復(fù)蘇后在T25方瓶中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿后，用0.25%胰酶消化分散細(xì)胞，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞形成約80%的單層時，按Lipofectamine 3000試劑說明書，向6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的ST細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Siat7e基因真核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48 h，更換含有10%牛血清、0.5 μg/mL G418的DMEM/F12培養(yǎng)基，此后每3 d更換一次培養(yǎng)基。在G418篩選壓力下培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察，待細(xì)胞全部表達(dá)綠色熒光蛋白，將細(xì)胞用胰酶消化擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存細(xì)胞。

1.4.2 細(xì)胞馴化 將1.4.1獲得的細(xì)胞采用逐步更換STP培養(yǎng)基培養(yǎng)和降低牛血清的方式，讓其適應(yīng)STP無血清培養(yǎng)基。具體操作為采用T25克氏瓶，用75%的DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%牛血清)和25%的STP培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞3代；50%的DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%牛血清)和50%的STP培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞3代；25%的DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%牛血清)和75%的STP培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞3代；直至完全適應(yīng)STP無血清培養(yǎng)基后，將ST細(xì)胞懸液按照初始密度1.0×106/mL接種到125 mL搖瓶，置37 ℃、5% CO2、110 r/min的搖床懸浮培養(yǎng)，每天取樣觀察細(xì)胞形態(tài)，計數(shù)細(xì)胞密度與活性，根據(jù)細(xì)胞的生長情況更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞完全適應(yīng)懸浮培養(yǎng)后，擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存細(xì)胞，將其命名為STS。將STS連續(xù)傳20代，研究STS細(xì)胞生長穩(wěn)定性。

1.5 STS細(xì)胞最佳接種密度確定及生物反應(yīng)器培養(yǎng)將STS細(xì)胞分別以0.2×106/mL、0.5×106/mL和1.0×106/mL三個初始密度接種于125 mL搖瓶進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每天取樣計密度與活性，確定細(xì)胞的最佳接種密度。將搖瓶培養(yǎng)的細(xì)胞逐步擴(kuò)大培養(yǎng)后，按搖瓶確定的最優(yōu)細(xì)胞接種密度接種7 L生物反應(yīng)器，設(shè)置生物反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)為：溫度37 ℃、pH7.2、攪拌轉(zhuǎn)速75 r/min和溶氧(DO)50%，每天取樣計密度與活性，確定生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的可行性。

1.6 STS細(xì)胞培養(yǎng)偽狂犬病毒工藝研究

1.6.1 細(xì)胞最佳接毒密度、最佳接毒量和收獲時間的確定 取對數(shù)生長期STS細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋成1.0×106/mL、2.0×106/mL和3.0×106/mL 三個密度，每個細(xì)胞密度分別接種至3個125 mL搖瓶，每瓶20 mL，同時每個細(xì)胞密度分別按照接毒量為0.01 MOI、0.1 MOI、1 MOI接種偽狂犬病毒C株，置37 ℃、5% CO2、110 r/min的搖床培養(yǎng)，在接毒后12 h開始每隔12 h取樣，測定病毒含量，確定接毒時細(xì)胞最佳密度、最佳接毒量和最優(yōu)收獲時間。

1.6.2 生物反應(yīng)器培養(yǎng)偽狂犬病毒工藝驗證 采用上述優(yōu)化的工藝參數(shù)，用50 L生物反應(yīng)器驗證工藝參數(shù)的可靠性。取搖瓶培養(yǎng)的種子細(xì)胞，按0.5×106/mL接種到7 L生物反應(yīng)器，培養(yǎng)體積為5 L，生物反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)為：溫度37 ℃、pH7.2、攪拌轉(zhuǎn)速75 r/min和DO為50%。待細(xì)胞密度達(dá)到4.5×106/mL時，擴(kuò)大培養(yǎng)至50 L生物反應(yīng)器，培養(yǎng)體積40 L，待細(xì)胞密度達(dá)到2.0×106/mL、2.5×106/mL和3.0×106/mL時，分別按0.1 MOI、0.5 MOI和1 MOI接種偽狂犬病毒，每隔12 h取樣測定病毒含量，確定病毒的增殖情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ST細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)的馴化 將ST細(xì)胞轉(zhuǎn)染Siat7e基因真核表達(dá)質(zhì)粒，G418篩選壓力下培養(yǎng)細(xì)胞3周，熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞全部表達(dá)綠色熒光蛋白(圖1)，表明獲得一株穩(wěn)定表達(dá)Siat7e基因ST細(xì)胞系。采用逐步更換STP培養(yǎng)基培養(yǎng)和降低牛血清的方式，細(xì)胞能夠完全適應(yīng)無血清培養(yǎng)。借此進(jìn)行了懸浮培養(yǎng)的馴化，獲得了適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的STS細(xì)胞；按照初始密度1.0×106/mL，培養(yǎng)72 h，密度達(dá)到6.0×106/mL(圖2)；連續(xù)傳代20代，細(xì)胞均正常生長，穩(wěn)定在5.1×106～6.6×106/mL之間，細(xì)胞傳代穩(wěn)定性良好(圖3)。

A:正常ST細(xì)胞；B:熒光顯微鏡下穩(wěn)定表達(dá)Siat7e基因的細(xì)胞；C：無血清培養(yǎng)的ST細(xì)胞A: Normal ST cells; B: Cells stably expressing Siat7e genes under fluorescence microscope;C: ST cells culture of serum-free圖1 穩(wěn)定表達(dá)Siat7e基因的細(xì)胞圖片F(xiàn)ig 1 Cell images of stable expression of Siat7e genes

圖2 STS細(xì)胞增殖曲線Fig 2 Proliferation curve of STS Cells

圖3 STS細(xì)胞傳代生長穩(wěn)定性Fig 3 STS cells growth stability of passage

2.2 STS細(xì)胞最佳接種密度確定及生物反應(yīng)器培養(yǎng)將STS細(xì)胞分別以0.2×106/mL、0.5×106/mL和1.0×106/mL三種密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。從圖4可以看出，以0.2×106/mL細(xì)胞密度接種時，生產(chǎn)較緩慢，活率下降較快；以0.5×106/mL和1×106/mL密度接種，細(xì)胞最高密度差異不大，為5×106～6×106/mL。確定細(xì)胞的最佳接種密度為0.5×106/mL～1.0×106/mL，培養(yǎng)傳代時間為72 h～96 h。按0.5×106/mL細(xì)胞接種密度接種7 L生物反應(yīng)器，培養(yǎng)96 h，密度達(dá)到6.1×106/mL，活率達(dá)95%，說明細(xì)胞能夠適應(yīng)生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)。

圖4 不同細(xì)胞密度接種STS細(xì)胞的生長曲線Fig 4 Growth curves of STS cells inoculated with different cell densities

2.3 偽狂犬病毒懸浮培養(yǎng)工藝優(yōu)化 接毒時采用1.0×106/mL、2.0×106/mL、3.0×106/mL三種細(xì)胞密度和0.01 MOI、0.1 MOI、1 MOI三種接毒量，用正交實驗確定最佳細(xì)胞接毒密度、最佳接毒量和收獲時間(表1)。無論那個細(xì)胞密度接種，0.1 MOI和1 MOI接毒，病毒的增殖均優(yōu)于0.01 MOI接毒，而且接毒量越大，病毒增殖達(dá)到高峰的時間越短，1 MOI接毒后病毒含量24 h最高，0.1 MOI接毒后病毒含量36 h最高；關(guān)于接毒時細(xì)胞密度，2.0×106/mL和3.0×106/mL接毒，病毒增殖的高峰均不低于109.0TCID50/mL，尤其是采用2.0×106/mL密度接種0.1 MOI病毒和采用3.0×106/mL密度接種1 MOI病毒時，病毒含量最高可以達(dá)到109.4TCID50/mL。因此病毒的最佳培養(yǎng)工藝為2.0×106/mL密度，接種0.1 MOI病毒，接毒后36 h收獲；或者3.0×106/mL密度，接種1 MOI病毒，接毒后24 h收獲?？紤]到生產(chǎn)實際控制準(zhǔn)確性，確定細(xì)胞的接毒量為0.1 MOI～1 MOI，接毒時細(xì)胞密度為2.0×106/mL～3.0×106/mL，收毒時間為接毒后24 h～36 h。

表1 接毒時不同細(xì)胞密度和接毒量對病毒增殖的影響Tab 1 Effects of different cell density and amount of virus inoculation on virus proliferation

2.4 生物反應(yīng)器培養(yǎng)偽狂犬病毒工藝驗證 采用搖瓶優(yōu)化的接毒工藝參數(shù)，用50 L生物反應(yīng)器驗證了工藝參數(shù)的可靠性。從7 L生物反應(yīng)器放大到50 L生物反應(yīng)器，待細(xì)胞密度達(dá)到2.0×106/mL，2.5×106/mL和3.0×106/mL時，分別按0.1 MOI、0.5 MOI和1 MOI接種偽狂犬病毒，病毒的增殖曲線如圖5，三批病毒含量均不低于109.0TCID50/mL，最高達(dá)到109.5TCID50/mL。

圖5 生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒增殖曲線Fig 5 Growth curve of virus in bioreactor culture

3 討論與結(jié)論

懸浮培養(yǎng)分為微載體懸浮培養(yǎng)和單細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)，其中單細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)以其無需載體、操作簡單、易于放大，成為當(dāng)前懸浮培養(yǎng)的主流技術(shù)。但目前疫苗生產(chǎn)采用的哺乳動物細(xì)胞多為貼壁依賴性細(xì)胞，需要經(jīng)過全懸浮培養(yǎng)的馴化。常用的細(xì)胞馴化方法一般先將細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)馴化，同時通過培養(yǎng)基的不斷優(yōu)化，使細(xì)胞能夠無血清高密度生長[6]，但整個過程耗時較長。Siat7e基因編碼α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，與細(xì)胞的貼壁性有關(guān)，其表達(dá)水平的提高可降低細(xì)胞的黏附性[7]。目前采用Siat7e基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞已經(jīng)成功馴化了MDCK懸浮細(xì)胞，用于流感疫苗的生產(chǎn)[8]。本研究將Siat7e基因轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，經(jīng)過篩選，獲得了穩(wěn)定表達(dá)Siat7e基因的ST細(xì)胞系，進(jìn)而馴化得到一株可懸浮培養(yǎng)的STS細(xì)胞株，此株細(xì)胞能夠穩(wěn)定連續(xù)傳代，連續(xù)培養(yǎng)20代細(xì)胞生長穩(wěn)定；適應(yīng)高密度生長，在無血清條件下培養(yǎng)，細(xì)胞最高密度可達(dá)6×106/mL，從搖瓶放大至7 L反應(yīng)器，生長穩(wěn)定。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通常會添加血清，但由于血清成分復(fù)雜，同時存在如Ca2+、Mg2+等成分會促進(jìn)細(xì)胞貼壁，因此，在得到穩(wěn)定表達(dá)Siat7e基因的ST細(xì)胞系后，通過逐步降低血清的方法實現(xiàn)了無血清培養(yǎng)，進(jìn)一步改善了細(xì)胞的貼壁性能，從而實現(xiàn)了細(xì)胞從貼壁培養(yǎng)到懸浮培養(yǎng)的馴化。同時無血清培養(yǎng)消除了培養(yǎng)基中血清成分，降低了疫苗生產(chǎn)制造下游的純化負(fù)荷，也為疫苗的質(zhì)量提升奠定了基礎(chǔ)。

接毒時細(xì)胞密度、接毒量和收獲時間是影響病毒增殖培養(yǎng)的三個關(guān)鍵因素，本研究采用STS細(xì)胞培養(yǎng)偽狂犬病毒，從接毒時細(xì)胞密度、接毒量、收獲時間三個方面進(jìn)行工藝優(yōu)化，病毒的最佳培養(yǎng)工藝為2.0×106/mL密度，接種0.1 MOI病毒，接毒后36 h收獲；或者3.0×106/mL密度，接種1 MOI病毒，接毒后24 h收獲?？紤]到生產(chǎn)實際控制準(zhǔn)確性，確定細(xì)胞的接毒量為0.1 MOI～1 MOI，接毒時細(xì)胞密度為2.0×106/mL～3.0×106/mL，收毒時間為接毒后24 h～36 h。經(jīng)過50 L生物反應(yīng)器3個批次的工藝驗證，培養(yǎng)的病毒含量均不低于109.0TCID50/ml，說明STS全懸浮細(xì)胞適合偽狂犬病毒的培養(yǎng)，為生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗提供了技術(shù)支撐。