HPLC法測定天然植物粗提物中芍藥苷含量

杜西翠，李云波，張 趁，郭艷欽，徐 丹，劉格格，王夢雪，李淑娜，朱秋艷

(1.河北錦坤動物藥業(yè)有限公司，辛集 052360； 2.辛集市中獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心，辛集 052360； 3.河北省獸用中藥制劑技術(shù)創(chuàng)新中心，辛集 052360； 4.河北省農(nóng)業(yè)創(chuàng)新驛站，辛集 052360； 5.河北省飼用天然植物提取物產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，辛集 052360；6.石家莊市匯豐動物保健品有限公司，辛集 052360； 7.樂亭縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，唐山 063600)

針對目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)中濫用抗生素導(dǎo)致的藥物殘留和細菌耐藥性等問題[1]，研究團隊開發(fā)出一款既可以代替抗生素使用又可以提高動物機體免疫力的新型飼料原料“黃芪白芍粗提物”。本產(chǎn)品是由黃芪、白芍等中藥材提取加工制備而成的天然植物粗提物，可以用于畜禽生長的各個階段，能夠有效減少臨床上抗生素的使用。為了控制產(chǎn)品的質(zhì)量，保證產(chǎn)品穩(wěn)定、有效，研究并測定其有效活性成分的含量具有非常重要的意義。

白芍收載于《中國獸藥典》2015年版二部，為毛莨科植物芍藥的干燥根，氣微，味微苦、酸。具有平肝止痛，養(yǎng)血斂陰的功效，主治肝陰不足，虛熱，瀉痢腹痛，四肢拘攣[2]。獸醫(yī)臨床中經(jīng)常與當(dāng)歸、熟地、桂枝、白術(shù)、甘草等配伍使用，用于治療血虛、陰虛、疼痛等病癥，具有很高的臨床應(yīng)用價值。主要含有芍藥苷、羥基芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷，以及苯甲酸、鞣質(zhì)、揮發(fā)油、脂肪油、樹脂、糖、黏液質(zhì)、蛋白質(zhì)、β-谷甾醇、草酸鈣、芍藥堿、牡丹酚及三萜類化合物等成分[3-4]。黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根是一種傳統(tǒng)的中藥材，具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，脫毒排膿，斂瘡生肌的功能[5]。現(xiàn)代研究表明，黃芪含皂苷、蔗糖、多糖、多種氨基酸、葉酸及硒、鋅、銅等多種成分，其中黃芪多糖是黃芪的主要有效成分[6]。經(jīng)查閱文獻[7-9]，黃芪多糖的含量多采用紫外分光光度法進行測定且組方為單一黃芪成分。復(fù)方產(chǎn)品進行黃芪多糖含量測定試驗缺乏專屬性，而進行黃芪甲苷測定則需要用到不常用的蒸發(fā)光散射檢測器且含量較低不易檢測。因此，本試驗以芍藥苷為測定指標(biāo)，測定了黃芪白芍粗提物中芍藥苷的含量，對于控制產(chǎn)品質(zhì)量和完善標(biāo)準具有實用性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Agilent-1260II(配備紫外檢測器)；AUW220D型十萬分之一電子分析天平：島津國際貿(mào)易有限公司，感量0.00001 g；KH-500E型數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 試藥 芍藥苷標(biāo)準品：中國食品藥品檢定研究院，含量98.7%，批號：Z0281506。黃芪白芍粗提物：河北錦坤動物藥業(yè)有限公司，批號：20200601，20200602，20200603。乙腈、甲醇、磷酸為色譜純；乙醇為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取芍藥苷對照品約10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2 供試品溶液制備 取黃芪白芍粗提物樣品搖勻，精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，充分搖勻，靜置，取上清液濾過，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)；流速為1 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為230 nm。對照品與供試品色譜圖見下圖。

圖1 芍藥苷對照品高效液相色譜圖Fig 1 High performance liquid chromatogram of paeoniflorin reference substance

圖2 黃芪白芍粗提物高效液相色譜圖Fig 2 High performance liquid chromatogram of crude extract of Radix Astragali and Radix Paeoniae Alba

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取芍藥苷對照品約10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。分別精密吸取芍藥苷對照品儲備液1、2、3、4、5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為稀釋液。照“2.3”項下色譜條件分別進樣對照品稀釋液和儲備液，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以對照品含量為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準曲線，進行線性回歸，得芍藥苷的回歸方程分別為：Y=10.6017X-14.8514，(r=0.99966)，結(jié)果表明芍藥苷在20～200 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。結(jié)果見圖3。

圖3 芍藥苷標(biāo)準曲線Fig 3 Standard curve of paeoniflorin

2.5 精密度試驗 分別精密吸取同一份對照品溶液10 μL，重復(fù)進樣6次，測定芍藥苷峰面積，計算芍藥苷峰面積的RSD為0.75%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果(n=6)Tab 1 Precision test results (n=6)

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批產(chǎn)品，精密量取1 mL，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，平行6份，照“2.3”項下色譜條件進行檢測分析，測定芍藥苷含量，計算芍藥苷含量的RSD為1.31%，表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果(n=6)Tab 2 Repeatability test results (n=6)

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密量取樣品1 mL，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h照“2.3”項下色譜條件進行檢測分析，測定芍藥苷的峰面積，計算其RSD為0.62%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=6)Tab 3 Stability test results (n=6)

2.8 回收率試驗 取已知含量的樣品9份，精密量取1 mL，分成3組，每組3份，分別按芍藥苷的80%、100%、120%加入芍藥苷對照品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3”項下色譜條件分別進樣進行檢測分析，計算平均回收率為101.3%，RSD值為0.66%。表明該方法測定結(jié)果的準確度高。結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗結(jié)果(n=9)Tab 4 Recovery test results(n=9)

2.9 樣品含量測定 取3批樣品，每批量取2份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件分別進樣進行檢測分析，記錄色譜圖，平行進樣兩次，計算平均含量。各批次樣品的含量見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果Tab 5 Determination results of sample content

3 討論與結(jié)論

3.1 流動相的考察[10-14]試驗對甲醇-水、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液四種流動相體系進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相時出峰時間晚且理論板數(shù)太低；以乙腈-水為流動相時對芍藥苷的洗脫能力強，出峰時間快，但在供試品中分離度不好，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰不易分開；乙腈-0.1%磷酸溶液對芍藥苷的出峰時間及供試品的分離度都有較好的表現(xiàn)。因此本試驗選擇了乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相。

3.2 供試品提取溶劑考察 試驗對乙醇、甲醇、50%乙醇、50%甲醇、乙腈-0.1%磷酸溶液五種不同提取溶劑進行了考察，結(jié)果乙醇、甲醇、乙腈-0.1%磷酸溶液提取的樣品分離度都小于1.5，達不到要求；用50%甲醇提取的樣品雜質(zhì)峰較多，芍藥苷含量偏低；而50%乙醇作為提取溶劑時，樣品雜質(zhì)峰少，色譜圖的分離度最好，芍藥苷含量最高。因此本試驗選擇了50%乙醇作為供試品提取溶劑。

3.3 柱溫 試驗考察了不同柱溫對芍藥苷色譜峰分離的影響，柱溫設(shè)置為25、30、35、40 ℃。柱溫為25 ℃時出峰時間晚且峰型較差；柱溫為40 ℃時出峰時間快但供試品目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的分離效果不理想，分離度小于1.5；柱溫為30、35 ℃時供試品色譜峰的分離度均符合要求，無明顯差異，但考慮柱溫太高會對色譜柱造成損害，因此柱溫選擇30 ℃。

3.4 結(jié)論 采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相測定植物粗提物中芍藥苷的含量，方法易行，結(jié)果可靠，為飼料原料及其相關(guān)制劑的質(zhì)量評價和含量檢測提供有效方法。