MMP-2、AIM2 在直腸癌組織中的表達及其與新輔助放化療 療效的關(guān)系

饒貴安，倪 眺，陳 強，蘇 藝

（梧州市紅十字會醫(yī)院胃腸外科，梧州 543002）

直腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，在消化系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率居第二位，流行病學(xué)研究顯示其發(fā)病率呈上升趨勢［1］。目前局部進展期直腸癌的治療以手術(shù)方式為主，而術(shù)前通過新輔助放化療（neoadjuvant chemoradiotherapy，nCRT）實現(xiàn)腫瘤降期，能顯著改善局部復(fù)發(fā)、增加保肛率和總體生存［2，3］。但在臨床實踐中，基于個體差異，并非全部患者均能通過nCRT 輔助治療獲益，相反對于nCRT 敏感性差的患者還可能延誤治療時間、承受不必要的放化療毒副作用［4］。因此尋找能預(yù)測局部進展期直腸癌nCRT 敏感性的分子標志物具有重要的臨床意義，成為臨床治療中亟待解決的問題。已有研究［5］顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）在腫瘤浸潤、遷移中具有重要作用，且在放化療前后表達存在明顯差異。黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）在放療誘導(dǎo)的細胞死亡及組織損傷中具有重要作用，可能是nCRT療效的潛在預(yù)測因子［6］。本研究通過檢測放化療前局部進展期直腸癌患癌組織MMP-2 和AIM2 表達情況，并探討其預(yù)測nCRT 療效的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018 年10 月～2019 年10 月本院98 例行新輔助放化療的局部進展期直腸癌患者為研究對象，年齡37～79（61.81±9.48）歲。納入標準：（1）符合直腸癌臨床診斷，并經(jīng)術(shù)前腸鏡活檢診斷局部進展期直腸癌；（2）年齡18 歲以上；（3）接受術(shù)前新輔助放化療治療者；（4）研究取得患者知情同意。排除標準：（1）合并其他系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤的患者；（2）放化療后未行腫瘤切除手術(shù)者；（3）不能配合完成本次研究者；（4）臨床病例資料不完整者。收集所有患者放化療前活檢石蠟標本及臨床資料。

1.2 新輔助放化療方法及療效評估 患者于術(shù)前接受同步放化療治療。采用三維適形全盆腔放療方式，總劑量50Gy，分25 次完成，同步化療方案采取FOLFOX方案2～3 個周期。新輔助放化療療效評估參照文獻［7］采用腫瘤消退程度分級（tumor regression grading，TRG）進行評定：TRG0，腫瘤無消退；TRG1，腫瘤輕微消退，腫瘤組織部分纖維化，但不超過25%；TRG2，腫瘤中度消退，纖維化成分占約26%～50%；TRG3，腫瘤消退良好，纖維化成分占50%以上；TRG4，腫瘤完全消退，無腫瘤細胞，僅見纖維化組織。其中TRG 0～2 判定為nCRT 不敏感，TRG 3～4 判定為nCRT 敏感［8］。

1.3 免疫組化檢測MMP-2、AIM2 蛋白表達

1.3.1 主要試劑 兔抗人MMP-2、AIM2 抗體（美國Sigma 公司），Envision 法免疫組織化學(xué)試劑盒（丹麥DAKO 公司），DAB 顯色試劑盒（丹麥DAKO 公司），羊抗兔IgG 二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3.2 免疫組化染色及判定標準 石蠟包埋的組織標本4μm 連續(xù)切片至過膠玻片上，56℃條件下烤片2h，使用二甲苯連續(xù)脫蠟3 次，梯度乙醇脫二甲苯，水洗。0.3%過氧化氫室溫孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。采用免疫組化Envision 法染色，染色步驟嚴格按說明書要求進行，采用DAB 顯色，嚴格控制顯色時間，常規(guī)脫水、封片。使用已知陽性切片作為陽性對照，PBS替代MMP-2、AIM2 一抗作為陰性對照。顯微鏡下隨機選取5 個切片視野（×200），再從各視野中觀察100個細胞，采用病理Path 軟件分析顯微鏡下細胞分布情況。判定標準：AIM2 及MMP-2 主要定位于細胞質(zhì)，以細胞質(zhì)染色強度結(jié)合陽性細胞百分比對其表達情況進行判讀，計算陽性細胞百分比并賦予分值，0%計為0分，～10%為1 分，～30%為2 分，～50%計3 分，50%及以上計4 分；觀察染色強度并賦予分值，無色計0 分，弱染色計1 分，適度染色計2 分，強染色計3 分。以上兩項分值乘積＜3 分為陰性（-），≥3 分為陽性（+）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用率表示，采取χ2檢驗；直腸癌nCRT 療效的獨立影響因素采用多因素Logistic 回歸模型分析；應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）評價各指標的診斷效能，AUC 比較使用Z 檢驗。所有檢驗均采取雙側(cè)檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2 與AIM 2 蛋白表達與新輔助放化療療效的關(guān)系 98 例接受術(shù)前nCRT 的患者中，61 例對nCRT治療敏感，其余37 例對nCRT 治療不敏感。nCRT 敏感組MMP-2 及AIM2 蛋白陽性表達率均顯著高于nCRT不敏感組（均P＜0.05），見表1。

表1 MMP-2與AIM2蛋白表達與新輔助放化療療效的關(guān)系（例，%）

2.2 nCRT 敏感組與nCRT 不敏感組臨床特征比較 對nCRT 敏感組與nCRT 不敏感組臨床特征進行分析，結(jié)果提示放化療前血清CEA 水平與直腸癌對nCRT 治療敏感與否顯著相關(guān)（P＜0.05），而年齡、性別、腫瘤位置、分化類型、臨床分期、臨床淋巴結(jié)分期與nCRT 治療敏感與否無關(guān)（均P＞0.05），見表2。

2.3 直腸癌nCRT 療效影響因素的多因素Logistic 回歸分析 以直腸癌患者對新輔助放化療是否敏感作為因變量（1=敏感，0=不敏感），?將表1 和表2 中有統(tǒng)計學(xué)差異的變量作為自變量納入多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果提示MMP-2 陽性、AIM2 陽性是直腸癌對nCRT 敏感的獨立影響因素（均P＜0.05），見表3。

2.4 ROC 曲線分析MMP-2、AIM 2 表達對直腸癌nCRT 療效的預(yù)測價值 繪制放化療前直腸癌組織中MMP-2、AIM2 蛋白及血清CEA 預(yù)測nCRT 療效的ROC曲線，見圖1。AIM2 預(yù)測nCRT 療效的AUC 分別大于CEA（Z=3.481，P=0.000）、MMP-2（Z=2.822，P=0.005）預(yù)測nCRT 療效的AUC，見表4。

3 討論

臨床研究表明對局部進展期直腸癌患者在實施手術(shù)前通過nCRT 輔助治療可使患者明顯獲益。然而既往大量的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，并非所有局部進展期直腸癌患者均對nCRT 輔助治療敏感，腫瘤的消退程度個體差異明顯，而在一些敏感性差的患者存在嚴重的nCRT 治療相關(guān)不良反應(yīng)［2］。此外，行nCRT 治療期間，一部分患者出現(xiàn)病情進展，甚至發(fā)生直腸癌遠處轉(zhuǎn)移，喪失手術(shù)治療機會。因此探討能預(yù)測直腸癌nCRT 療效的指標具有顯著的臨床意義，有助于減輕患者負擔，幫助臨床醫(yī)師實現(xiàn)精準化、個體化治療。既往研究［9］顯示，血清CEA 水平與nCRT 敏感性具有密切聯(lián)系，CEA 水平低的患者放化療療效更好。本研究也有類似發(fā)現(xiàn)，放化療前血清CEA 水平與直腸癌患者對nCRT 治療的敏感性明顯相關(guān)，但ROC 曲線分析顯示其AUC 在0.5～0.7之間，因此預(yù)測效能不高。

表2 nCRT敏感組與nCRT不敏感組臨床特征比較

表3 直腸癌nCRT療效影響因素的多因素Logistic回歸分析

圖1 MMP-2、AIM2及CEA預(yù)測直腸癌nCRT療效的ROC曲線

表4 MMP-2、AIM2及CEA預(yù)測直腸癌nCRT療效的效能比較

基質(zhì)金屬蛋白酶是一組依賴于鋅離子的具有降解細胞外基質(zhì)活性的內(nèi)肽酶家族，已被大量報道證實在腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］。MMP-2 歸屬于基質(zhì)蛋白酶基質(zhì)中的明膠酶類，已有資料［11］表明，MMP-2 能夠介導(dǎo)腫瘤細胞外基質(zhì)降解，這一功能在多種腫瘤的癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵性作用。另外，報道顯示MMP-2 參與調(diào)節(jié)、降低腫瘤細胞間粘附力，使其易于脫落而形成遠處轉(zhuǎn)移。既往報道［12］中，新輔助化療能通過降低乳腺癌MMP-2 表達，抑制乳腺癌細胞侵襲力，從而減少乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究中，nCRT 敏感組MMP-2 陽性表達率明顯高于nCRT 不敏感組，提示放化療前直腸癌組織中MMP-2 表達水平與nCRT 治療效果密切相關(guān)。經(jīng)多因素Logistic 回歸分析提示MMP-2 陽性表達是直腸癌nCRT 療效的獨立影響因素，提示MMP-2 可能是預(yù)測nCRT 療效的潛在生物標志物。為進一步評價放化療前腫瘤組織中MMP-2 在預(yù)測nCRT 療效中的價值，本研究利用ROC 曲線評價，結(jié)果表明MMP-2 預(yù)測nCRT療效具有一定價值，ROC 曲線下面積均大于0.7。但MMP-2 過表達影響nCRT 敏感性的相關(guān)機制仍有待進一步明確。

AIM2 是一種模式識別受體，生理情況下AIM2 通過識別外源性細菌、病毒甚至自身雙鏈DNA 等病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），并進一步激活炎癥小體途徑以對抗外源性感染因素或清除自身損傷相關(guān)分子［13，14］。局部進展期直腸癌患者腫瘤細胞受nCRT 作用后，可以發(fā)生AIM2 聚集現(xiàn)象［15］。本研究中，AIM2 是直腸癌nCRT 療效的獨立影響因素，經(jīng)ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)AIM2 預(yù)測nCRT 療效價值較高，其預(yù)測效能明顯高于MMP-2 和CEA。AIM2 過表達如何導(dǎo)致直腸癌對新輔助放化療耐受的機制目前不明。近來研究發(fā)現(xiàn)，在放化療導(dǎo)致的機體細胞DNA 破壞時，細胞核中的AIM2蛋白與受損的雙鏈DNA 結(jié)合，可以合成炎癥復(fù)合體，激活Caspase-1 并介導(dǎo)IL-1β引發(fā)的細胞凋亡［16］。筆者推測AIM2 作為一種模式識別受體，通過識別放化療損傷的腫瘤細胞DNA 并進一步激活凋亡相關(guān)信號通路可能是AIM2 影響nCRT 敏感性的相關(guān)機制，但仍有待進一步明確。

綜上所述，局部進展期直腸癌放化療前腫瘤組織中MMP-2、AIM2 陽性表達的患者更易獲得較好的nCRT 治療療效，二者對nCRT 療效具有較好的預(yù)測價值，但相關(guān)作用機制有待進一步研究探討。