T-SPOT.TB、TB-LAMP、TB-DNA 定量對肺結核的診斷價值分析

李秀萍，趙雪梅，嚴曉蕓，李 葉，王 玲，董 力，魏連存

（青海省第四人民醫(yī)院，西寧 810000）

肺結核是由結核分枝桿菌傳染而引起的慢性傳染性疾病，是我國的高發(fā)性傳染病，可累及機體多個器官，以肺部感染最常見，主要表現(xiàn)為午后低熱、盜汗、乏力、消瘦、咳嗽咳痰、咯血、呼吸困難等，嚴重威脅國民的生活質量與生命健康［1-2］。研究表明，結核桿菌入侵人體后不一定會即刻致病，若能早診斷，早治療，肺結核患者大多可臨床治愈，預后良好［3］。長期以來，痰培養(yǎng)是臨床診斷肺結核的金標準，但近年來，如γ干擾素釋放試驗（Tuberculous bacillus-interferon release test，T-SPOT.TB）、實時熒光核酸恒溫擴增技術（Real-time fluorescent nucleic acid thermostatic amplification technology，SATTB）、肺結核核酸（Tuberculous bacillus-DNA，TB-DNA）定量等多種新型診斷技術可在分子水平對肺結核進行檢測，為肺結核患者的診斷帶來了新可能［4-5］。在上述研究背景下，本研究分別采用了T-SPOT.TB、SAT-TB、TB-DNA 定量對肺結核進行診斷，來探討其診斷價值，旨為臨床診斷肺結核提供一種新視角。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年1 月～2020 年6 月本院的疑似肺結核患者153 例，一般資料見后述。納入標準：均為疑似肺結核患者。排除標準：合并有除肺結核外其他傳染性疾病者；合并凝血功能障礙者；合并免疫功能障礙者；合并惡性腫瘤者。按痰培養(yǎng)確診后結果分為肺結核組（n=78）與非肺結核組（n=75）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會會議表決通過。

1.2 檢測方法

1.2.1 痰培養(yǎng)試驗 采集患者痰標本后用齊爾-尼爾森染色法對其進行染色，試劑均購自北京凱瑞基生物科技有限公司，具體操作流程與評判標準均嚴格參照相關文獻標準［6］。

1.2.2 T-SPOT.TB 采集患者外周靜脈血清5mL，置于抗凝管內加肝素保存?zhèn)溆?。用結核感染T 細胞實驗試劑盒檢測患者外周靜脈血清，記錄斑點數(shù)，評判標準：A 孔或B 孔斑點數(shù)≥6 即為陽性，反之為陰性。試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司，相關操作流程均嚴格參照試劑說明書。

1.2.3 SAT-TB 采集患者痰標本后用SAT-TB 試劑盒對其中的分枝桿菌DNA 進行提取、擴增，擴增完成后用熒光檢測儀（美國GE，6022T）檢測樣本是否有熒光顯示，有為陽性，無為陰性。相關操作流程均嚴格參照儀器和試劑說明書，試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司。

1.2.4 TB-DNA 定量 采集患者痰標本后用FQ-PCR儀（美國ABI，QuantStudio3）對其中的分枝桿菌DNA 進行擴增，用熒光定量檢測試劑盒檢測其DNA 表達量，結果以＞50 拷貝為陽性，反之為陰性。相關操作流程均嚴格參照儀器和試劑說明書，試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司。

1.3 觀察指標 對所有患者均行T-SPOT.TB、SATTB、TB-DNA 定量檢測，觀察比較三種檢測方法診斷肺結核的敏感度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值、kappa 值。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 23.0 進行研究資料分析。觀測資料中的計量數(shù)據(jù)，均通過正態(tài)性檢驗，以mean±SD 描述。兩組間的比較為成組t 檢驗或校正t 檢驗（統(tǒng)計量為t）。 計數(shù)資料以例數(shù)及率描述。組間比較為卡方檢驗或校正卡方檢驗（統(tǒng)計量為χ2）。診斷評估價值分析為配對卡方檢驗及ROC（receiver operation characteristic，接收者工作特征曲線）分析。 統(tǒng)計推斷的檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 肺結核組與非肺結核組一般資料比較 肺結核組與非肺結核組在年齡、性別、吸煙史、血壓、心率上均無明顯差異（P＞0.05）（表1）。

表1 肺結核組與非肺結核組一般資料比較

2.2 三種檢測方法的診斷敏感度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值、kappa 值比較 T-SPOT.TB、SAT-TB、TB-DNA 定量三種檢測方法診斷肺結核的敏感度%分別為93.6、83.3、71.8，特異度%分別為96.0、96.0、97.3，準確度%分別為94.1、83.7、70.6，三組差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中，T-SPOT.TB 診斷肺結核的敏感度、特異度、準確度均大于SAT-TB、TBDNA 定量檢測，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2，表3，ROC 曲線見圖1。

三種檢測方法的kappa 值分別為0.882、0.673、0.411，T-SPOT.TB 的kappa 值均大于SAT-TB、TB-DNA定量的kappa 值。

表2 三種方法在各組中的檢測結果（例，n）

表3 三種檢測方法的診斷敏感度、特異度、準確度比較，n（%）

2.3 三種方法間聯(lián)合檢測的診斷敏感度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值、kappa 值比較 根據(jù)臨床習慣做法，設計了T-SPOT.TB+另外兩種方法的聯(lián)合應用，共3 種（T-SPOT.TB+SAT-TB，T-SPOT.TB+TBDNA，T-SPOT.TB+SAT-TB+TB-DNA）。經(jīng)觀測，三種聯(lián)合檢測方法的診斷敏感度、特異度、準確度均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表4，ROC 曲線見圖1。

結合前述表3 結果來看，三種聯(lián)合檢測方法的診斷敏感度、特異度、準確度僅略高于T-SPOT.TB 的單獨應用。

表4 三種方法間聯(lián)合檢測的診斷敏感度、特異度、準確度比較，n（%）

3 討論

肺結核是由結核分枝桿菌引起的肺部感染性疾病，主要通過呼吸道飛沫傳播，傳染性強，全世界每年的肺結核發(fā)病人數(shù)逾千萬，我國是典型的肺結核疫情高負擔國家，發(fā)病人數(shù)高居全球第2，如何防治肺結核已成為我國乃至世界亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題［7］。研究表明，結核分枝桿菌的感染、潛伏與人類的SLC11A1 基因多態(tài)性與人群易感性有關，其致病多具有條件性，感染早期患者多無自覺癥狀，當由于內、外界因素而導致人體免疫功能下降、細菌大量繁殖或細胞介導的炎癥反應加強時才得以致病，因此尋求多方面、有效的診斷方式成為臨床防治肺結核的關鍵［8］。T-SPOT.TB、SAT-TB、TB-DNA 定量作為臨床診斷肺結核的新興技術，其診斷價值孰大孰小尚未明了［9］?，F(xiàn)為比較T-SPOT.TB、SATTB、TB-DNA 定量對肺結核的診斷價值，特做此研究。

本研究結果顯示，T-SPOT.TB、SAT-TB、TB-DNA定量等三種方法間聯(lián)合檢測的診斷效能較單獨檢測提高不多，且T-SPOT.TB 診斷肺結核的敏感度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值、kappa 值均明顯大于SAT-TB、TB-DNA 定量檢測，提示相比聯(lián)合檢測與SAT-TB、TB-DNA 定量檢測，T-SPOT.TB 具有很強的鑒別肺結核能力，能更準確地判斷受檢者是否真實患有肺結核，甚至與作為肺結核診斷金標準的痰培養(yǎng)檢測具有較高的一致性。

究其原因，可能是因為結核分枝桿菌的致病過程主要可分為起始期、T 細胞反應期、共生期和細胞外繁殖傳播期［10］。侵入呼吸道的結核菌被肺泡巨噬細胞吞噬，而后在肺泡巨噬細胞內存活和復制，擴散至鄰近非活化的肺泡巨噬細胞和形成早期感染灶。在T 細胞反應期，結核菌在巨噬細胞內繼續(xù)生長，引發(fā)由T 細胞介導的細胞免疫和遲發(fā)性變態(tài)反應，形成中心呈固態(tài)干酪壞死的結核灶，從而限制結核菌繼續(xù)復制，這一病理過程對結核病的發(fā)生發(fā)展及預后轉歸起著決定性作用，且大多數(shù)感染者均可發(fā)展至T 細胞反應期，因此這一時期也成為肺結核的標志性病理生理時期［11-12］。T-SPOT.TB 利用了酶聯(lián)免疫斑點技術以及特異度抗原ESAT-6、CFP-10，能通過記錄斑點數(shù)反映由結核分枝桿菌引起、由T 細胞介導的細胞免疫反應過程中產(chǎn)生的效應T 淋巴細胞數(shù)量，從而反映患者是否存在T 細胞反應期，并以此來判斷患者是否存在結合分枝桿菌感染［13］。相反，SAT-TB、TB-DNA 定量檢測均使用到了DNA 擴增技術，在DNA 擴增過程中，由于容易出現(xiàn)實驗器材污染的問題，易造成誤差，并加以放大，從而出現(xiàn)假陽性，而結核分枝桿菌作為L 型細菌，由于缺壁并合有代償性細胞膜增厚，一般常用溶菌酶難以使其細胞膜破裂釋出DNA，從而又容易出現(xiàn)假陰性［14］，降低了診斷效能。ZHANG Yumeng 等人［15］的研究表明，T-SPOT.TB、TB-DNA 定量的敏感性分別為96%、64%，特異度分別為88%、67%，且T-SPOT.TB 與聯(lián)合痰培養(yǎng)能提高肺結核的診斷陽性率；Linchuan 等人［16］的研究表明，T-SPOT.TB 可不受實驗樣本采集的影響，診斷活肺結核的陽性率、靈敏度均高于SAT-TB，且對活動性肺結核亦具有較高的診斷特異度；Tong-Tong Y 等人［17］的研究表明，T-SPOT.TB 可提高結核菌素試驗陰性、TB-DNA 定量檢測陰性患者中結核分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)率，提高耐藥性肺結核的診斷效能。上述研究報道均與本研究結果相一致。而聯(lián)合檢測法的診斷效能并不非常高于T-SPOT.TB 單獨檢測法，可能是因為T-SPOT.TB主要利用免疫反應來實現(xiàn)檢測目的，與SAT-TB、TBDNA 定量利用DNA 擴增的檢測原理相差較大，在檢測陽性率上較難達成一致，從而造成了T-SPOT.TB 檢測方法“一枝獨秀”，而其它兩法診斷效能較低的現(xiàn)象。

T-SPOT.TB 對肺結核的診斷價值要大于SAT-TB、TB-DNA 定量檢測，有望成為替代痰培養(yǎng)的檢測方法，值得臨床進一步推廣應用。