錯(cuò)配修復(fù)蛋白及PD-L1 在彌漫浸潤(rùn)型胃癌中的表達(dá)及意義

李 薇，王文杰，谷昀昌，虞紅珍，程懷東

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院：1.腫瘤科；3.病理科，合肥 230601；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院2017級(jí)，合肥 23000）

胃癌是我國(guó)最常見的消化道惡性腫瘤，其中彌漫浸潤(rùn)型胃癌是具有獨(dú)特生物學(xué)特性的一種亞型，易發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，常被漏診誤診，化療療效欠佳，治療方法有限，預(yù)后很差［1］。DNA 錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）糾正DNA 復(fù)制過程中產(chǎn)生的錯(cuò)配，MMR 功能異常或缺失（Deficient mismatch repair，dMMR），導(dǎo)致表型突變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定（Microsatellite instability，MSI），與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［2］。研究發(fā)現(xiàn)大腸癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中存在dMMR 與MSI［3-4］。程序性死亡蛋白 1（programmed cell death protein 1，PD-1）是B7 家族成員。PD-1 與配體PD-L1 結(jié)合后抑制T 細(xì)胞活化，從而抑制機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。研究發(fā)現(xiàn)肺癌、頭頸部腫瘤、大腸癌等多種腫瘤組織中存在PD-L1 的陽性表達(dá)［5-7］，PD-1、PD-L1 免疫檢查點(diǎn)抑制劑可解除PD-1/PD-L1 的免疫抑制，在多種進(jìn)展期腫瘤中應(yīng)用取得了一定的療效［8］。目前彌漫浸潤(rùn)型胃癌發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。本研究通過探討錯(cuò)配修復(fù)蛋白及PD-L1 對(duì)彌漫浸潤(rùn)型胃癌發(fā)生發(fā)展的影響，為臨床應(yīng)用檢免疫查點(diǎn)抑制治療提供一定的理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月～2019 年8 月我院收治的彌漫浸潤(rùn)型胃癌，病理為印戒細(xì)胞癌或伴低分化腺癌，共選取患者33 例，其中男24 例，女9 例；年齡32～76 歲，平均年齡59 歲。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均確診胃癌，接受了胃癌根治術(shù)，病理為彌漫浸潤(rùn)型印戒細(xì)胞癌伴低分化腺癌；（2）術(shù)前無化療、放療、靶向、免疫治療等治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有重要臟器嚴(yán)重疾??；（2）嚴(yán)重免疫性疾患。

1.3 檢測(cè)方法 錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLHl、PMS2、MSH2、MSH6 表達(dá)檢測(cè)方法：由組織蠟塊切片，樣品制備，經(jīng)脫臘，抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷。再經(jīng)一抗（MLH-1：邁新，MAB-0642；MSH-2：邁新，MAB-0291；MSH-6：邁新，MAB-0643；PMS-2：邁新，MAB-0656），二抗（安必平：Vbrightl）。然后經(jīng)DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明封片后讀片。陰性對(duì)照為磷酸鹽緩沖液，陽性對(duì)照為選取已明確為陽性的標(biāo)本切片。

PD-L1 表達(dá)檢測(cè)方法：由組織蠟塊切片，樣品制備，脫臘，使用PT Link 儀器上的三合一流程進(jìn)行脫蠟，水化和抗原修復(fù)。將帶有切片的 Autostainer 切片架置于Autostainer Link 48 上，應(yīng)用PD-L1 免疫組化診斷試劑盒 22C3 PharmDx，按照試劑盒流程進(jìn)行。余按 MMR 檢測(cè)流程進(jìn)行復(fù)染及封片后讀片。陰性對(duì)照為磷酸鹽緩沖液，陽性對(duì)照為選取已明確為陽性的標(biāo)本切片。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 錯(cuò)配修復(fù)蛋白陽性表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)：MSH2、MLHl、MSH6、PMS2 蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，以細(xì)胞核為主，在腫瘤細(xì)胞明確著色黃色或棕黃色判定為陽性，任何比率腫瘤細(xì)胞的陽性均視為陽性，無著色判斷為陰性。任一錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)陰性即為錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷（Deficient mismatch repair，dMMR），所有錯(cuò)配蛋白均陽性表達(dá)為錯(cuò)配修復(fù)功能正常（Proficient mismatch repair，pMMR）。

PD-L1 陽性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：以聯(lián)合陽性分?jǐn)?shù)（Combined Positive Score，CPS）為判斷標(biāo)準(zhǔn)，即任意強(qiáng)度膜染色的腫瘤細(xì)胞、與腫瘤細(xì)胞直接關(guān)聯(lián)的膜/胞質(zhì)染色的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)，相對(duì)于所有腫瘤細(xì)胞的比例分?jǐn)?shù)，再乘以100。CPS 值大于1 即為PD-L1 表達(dá)陽性，反之為陰性。

1.5 觀察結(jié)果 彌漫浸潤(rùn)型胃癌組織中MSH2、MLHl、MSH6、PMS2 及PD-L1 的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本次研究數(shù)據(jù)處理使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 33 例胃癌患者，其中男性24 例，女性9 例；年齡32～76 歲，平均年齡59 歲。病灶主要浸潤(rùn)部位：胃底胃體2 例，胃體18 例，胃竇7 例，胃體胃竇3例，胃底胃竇1 例。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11 例（33.3%）、脈管癌栓13 例（39.4%）、神經(jīng)侵犯27 例（81.8%），癌組織發(fā)生嗜神經(jīng)侵犯較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯升高（P＜0.05），見表1。

表1 一般資料

2.2 MSH2、MLHl、MSH6、PMS2 及PD-L1 陽性表達(dá)情況 33 例胃癌患者中，免疫組化檢測(cè)MLHl、PMS2表達(dá)缺失發(fā)生各1 例，其余錯(cuò)配修復(fù)蛋白均為陽性表達(dá)；PD-L1 免疫組化檢測(cè)表達(dá)均為陰性，見表2、圖1。

表2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、PD-L1表達(dá)情況

圖1 免疫組化

3 討論

德國(guó)病理學(xué)家Borrmann 根據(jù)腫瘤蔓延浸潤(rùn)、以及腫瘤與周邊組織邊界情況將進(jìn)展期胃癌分為Ⅰ～Ⅳ型，彌漫浸潤(rùn)型胃癌為Borrmann Ⅳ型，是進(jìn)展期胃癌中少見的一種類型，易出現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移。內(nèi)鏡下觀察病變處黏膜粗糙，呈結(jié)節(jié)狀隆起或凹凸不平，黏膜充血、水腫、糜爛，或伴潰瘍形成，而CT 多表現(xiàn)為胃壁局限性或廣泛性不規(guī)則增厚，增強(qiáng)后增厚胃壁明顯強(qiáng)化，病變組織與正常胃壁組織分界不清，胃腔變形或胃腔狹小，病變處胃漿膜面毛糙，與周圍脂肪間隙模糊不清或消失，對(duì)于診斷Borrmann IV 型胃癌，CT 的準(zhǔn)確性顯著高于胃鏡［9］。

彌漫浸潤(rùn)型胃癌以印戒細(xì)胞癌或低分化腺癌為主，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究對(duì)33 例患者病理資料分析發(fā)現(xiàn)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11 例（33.3%）、脈管癌栓13 例（39.4%）、神經(jīng)侵犯27 例（81.8%），癌組織發(fā)生神經(jīng)侵犯較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯升高。胃癌亦是一種高度異質(zhì)性腫瘤，這類胃癌嗜神經(jīng)性機(jī)制尚不十分明確，是否有特殊的分子發(fā)病機(jī)制，值得進(jìn)一步研究。

錯(cuò)配修復(fù)基因是一組高度保守的看家基因，通過編碼錯(cuò)配修復(fù)蛋白修復(fù) DNA 復(fù)制時(shí)出現(xiàn)的錯(cuò)配，維持基因組的穩(wěn)定性。MMR 系統(tǒng)在參與DNA 修復(fù)時(shí)可涉及到多個(gè)錯(cuò)配修復(fù)蛋白，包括MutS（MSH2、MSH3 和 MSH6等）和MutL（MLH1、MLH3、PMS1 和 PMS2）兩大家族，其中，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 是MMR 的主要蛋白，在DNA 錯(cuò)配修復(fù)時(shí)起關(guān)鍵作用［2］。這4 種MMR 蛋白中任意1 種及以上表達(dá)缺失判定為DNA 錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷（dMMR），出現(xiàn)dMMR 的基因組穩(wěn)定性就會(huì)降低，突變率升高。文獻(xiàn)報(bào)道在結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中存在一定的錯(cuò)配功能缺陷及微衛(wèi)星不穩(wěn)定，795 例結(jié)直腸癌腫瘤組織中，12.2%的CRC 具有MMR 蛋白缺陷（dMMR）表型，11.5%的CRC 具有較高的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，dMMR 是獲得更好預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素［10］。而本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在33 例彌漫浸潤(rùn)型胃癌中錯(cuò)配修復(fù)蛋白陽性表達(dá)率均較高，其中僅1 例MLH1、1 例PMS2 表達(dá)缺失，提示在彌漫浸潤(rùn)性胃癌中dMMR 發(fā)生率低，DNA突變率可能不高。本研究與日本學(xué)者Hirotsu 等報(bào)道十分相近，Hirotsu 研究中發(fā)現(xiàn)，38 例胃彌漫印戒細(xì)胞癌的MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 蛋白免疫組化染色，所有胃腫瘤組織都表達(dá)MMR 蛋白，未發(fā)現(xiàn)1 例dMMR，在該研究中進(jìn)一步查詢了癌癥基因組圖譜（TCGA）基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)99 例彌漫型胃癌樣本中只有6 例（6%）顯示MMR 不足［11］。另外，Tamura 等在其研究中報(bào)道了在胃彌漫印戒細(xì)胞癌中沒有發(fā)現(xiàn)MSIH（0/14，0%），與本研究亦較為一致［12］，因此提示DNA 錯(cuò)配修復(fù)功能異?？赡懿皇菑浡?rùn)型胃癌主要的發(fā)病機(jī)制。

程序性死亡蛋白 1（programmed cell death protein 1，PD-1）是B7 家族成員，是活化的T 細(xì)胞，特別是細(xì)胞毒性T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞上表達(dá)的關(guān)鍵抑制性受體。PD-1 具有兩種配體：程序性死亡配體 1（programmed death-ligand 1，PD-L1）和 PD-L2。PD-1/PD-L1 結(jié)合后抑制T 細(xì)胞活化，導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸。研究認(rèn)為多種惡性腫瘤細(xì)胞存在PD-L1 的表達(dá)［13］。而在本研究中，33 例彌漫浸潤(rùn)型胃癌組織中未發(fā)現(xiàn)PD-L1 的陽性表達(dá)，這可能與樣本量少有關(guān)，提示了在彌漫浸潤(rùn)型胃癌中PD-L1 陽性表達(dá)率不高。日本學(xué)者Jin 亦發(fā)現(xiàn)243 例胃癌組織中PD-L1 陽性表達(dá)率43%，所有PD-L1 陽性中彌漫型胃癌組織陽性表達(dá)率僅為31%，明顯低于Lauren 腸型［14］，與本研究結(jié)果較為相似。免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以解除免疫抑制，提高抗腫瘤 T 細(xì)胞的活性，增強(qiáng)抗腫瘤能力，但本研究提示應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療彌漫浸潤(rùn)型胃癌有效率可能不高。

DNA 錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷可能不是彌漫浸潤(rùn)型胃癌的主要發(fā)病機(jī)制，應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療臨床獲益的可能性不大。本研究檢測(cè)結(jié)果或許與樣本量不大有關(guān)，再者PD-L1 在腫瘤或免疫細(xì)胞的表達(dá)雖重要，但并非絕對(duì)的療效預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志，還有哪些？另外發(fā)現(xiàn)彌漫浸潤(rùn)型胃癌中嗜神經(jīng)侵犯的發(fā)生率明顯淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移，究其原因？這些都有待于在今后工作中進(jìn)一步研究。