血小板膜糖蛋白特異性抗體在兒童免疫性血小板減少癥中的 表達(dá)及臨床意義

張 晴，高長俊，李 旭，任 蓉，韓 靜

（唐山市婦幼保健院 小兒血液科，唐山 063000）

兒童免疫性血小板減少癥是兒童最為常見的出血性疾病之一，主要表現(xiàn)為血小板的異常，皮膚和粘膜發(fā)生自發(fā)性出血［1］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)［2-3］，與正常成人相比，兒童免疫性血小板減少癥的實(shí)驗(yàn)室檢查存在顯著差異，絕大多數(shù)兒童免疫性血小板減少癥均有一定的自限性，且預(yù)后較好。目前研究認(rèn)為兒童免疫性血小板減少癥的發(fā)病機(jī)制主要為機(jī)體T 細(xì)胞的異常性增生以及巨核細(xì)胞的分化成熟不良。血小板膜糖蛋白特異性抗體對于臨床鑒別免疫性與非免疫性血小板減少癥具有重要意義，其主要包括GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ，主要通過對Fc-途徑進(jìn)行血小板的清除作用，同時也可通過對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的誘導(dǎo)作用的顯著激活，進(jìn)而影響其血小板的活化以及凋亡，進(jìn)一步加劇兒童免疫性血小板減少癥的產(chǎn)生［4］。本研究主要通過血小板膜糖蛋白特異性抗體在兒童免疫性血小板減少癥中的表達(dá)及臨床意義分析，為臨床診斷以及預(yù)后判定提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為橫斷面調(diào)查，選擇2018 年3月～2019 年10 月在本院就診的兒童免疫性血小板減少癥患兒120 例作為研究對象，其中，男性患兒69 例，女性患兒51 例，平均年齡（3.82±1.11）歲，病程平均為（8.22±2.54）月，平均血小板計數(shù)為（32.11±13.22）109，另選取同期健康體檢的健康患兒120 例作為對照組，兩組患兒的性別、年齡、體重指數(shù)之間的差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見表1。所有患兒均簽署知情告知書，并經(jīng)倫理委員會論證并批準(zhǔn)。

患兒入選標(biāo)準(zhǔn)：①所有患兒均符合兒童免疫性血小板減少癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②兩次血常規(guī)檢測，患兒的血小板計數(shù)早100*109以下，患兒的紅細(xì)胞形態(tài)未見異常；③皮膚出血、瘀斑以及臟器出血。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他繼發(fā)性的血小板減少征；②免疫系統(tǒng)疾病；③造血系統(tǒng)疾病；④嚴(yán)重器質(zhì)性功能障礙患兒。

表1 兩組基線資料比較

1.2 研究方法 血小板膜糖蛋白特異性抗體檢測：所有研究對象入組后，采集患兒的靜脈血4mL 后，使用EDTA 進(jìn)行抗凝處理，3500r/min 離心15min。分離血漿至于-80℃冰箱進(jìn)行保存。取正常人體O 型血小板，調(diào)整其密度為109/L 的懸浮液，在EP 管中加入以上研究對象的血漿以及血小板懸浮液各100μL，混勻后，在室溫條件下進(jìn)行孵育，孵育時間設(shè)定為60min。同時使用PBS 液對上述孵育后的混合液體進(jìn)行沖洗3 次，沖洗結(jié)束后，EP 管中加入血小板裂解液100μL，混勻后在4℃的冰箱中進(jìn)行孵育30min，再次，3500r/min 離心30min，將獲得的上清液按照1：5 的比例進(jìn)行稀釋，以上樣本100μL 加入俘獲當(dāng)單抗羊抗鼠抗體的酶標(biāo)板上，在室溫條件下進(jìn)行震蕩孵育60min，同時再次使用PBS 液對上述孵育后的混合液體進(jìn)行沖洗4 次，每孔中再次加入100μL 的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人抗體，密封后再次在室溫條件下震蕩60min，采用PBS 液對上述孵育后的混合液體進(jìn)行沖洗6，隨后加入100μL 的底物緩沖液，在37℃下進(jìn)行孵育3 小時，使用酶標(biāo)儀分別對GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體的吸光度值進(jìn)行測量。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 兩組GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平之間的差異 分別對觀察組以及對照組的GP Ⅱb/Ⅲa以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平進(jìn)行比較。

1.3.2 不同出血程度患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平比較 按照出血分級標(biāo)準(zhǔn)，分別對0、1、2 級患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平進(jìn)行比較。

1.3.3 不同預(yù)后患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平之間的差異 分別對三個月內(nèi)緩解患兒以及未緩解患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平進(jìn)行比較。患兒的緩解主要表現(xiàn)為治療后患兒的血小板計數(shù)在30*109以上，相比治療前，其血小板的提升幅度在2 倍以上，患兒的出血癥狀顯著下降。

1.3.4 GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ聯(lián)合診斷對兒童免疫性血小板減少癥診斷效能分析 采用ROC 曲線對GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ聯(lián)合診斷效能進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 文中數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行匯總分析。計量資料以mean±SD 表示，比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，計數(shù)資料以［n（%）］表示，采用卡方檢驗(yàn)，聯(lián)合檢測效能分析采用ROC 曲線，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平比較 觀察組患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平顯著高于對照組（t=107.778，69.879，P＜0.05），詳見表2。

表2 兩組GPⅡb/Ⅲa以及GPⅠb/Ⅸ抗體水平比較

2.2 不同出血程度患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平比較 不同出血程度患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），隨著患兒的出血程度的加重，患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平顯著提升（P＜0.05），詳見表3。

2.3 不同預(yù)后患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平之間的差異 緩解組患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體顯著低于未緩解組（t=17.262，18.159，P＜0.05），詳見表4。

2.4 GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ聯(lián)合診斷對兒童免疫性血小板減少癥診斷效能分析 在對兒童免疫性血小板減少癥診斷中，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ的聯(lián)合診斷靈敏度顯著高于單獨(dú)檢測，通過ROC 曲線分析（圖1），在對兒童免疫性血小板減少癥診斷中，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ的臨界值分別為0.47，0.55，詳見表5。

表3 不同出血程度患兒的GPⅡb/Ⅲa以及GPⅠb/Ⅸ抗體水平比較

表4 不同預(yù)后患兒的GPⅡb/Ⅲa以及GPⅠb/Ⅸ抗體水平之間的差異

表5 GPⅡb/Ⅲa以及GPⅠb/Ⅸ聯(lián)合診斷對兒童免疫性血小板減少癥診斷效能分析

3 討論

兒童免疫性血小板減少癥的發(fā)病較為復(fù)雜［6］，目前認(rèn)為，血小板的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平是疾病進(jìn)展的重要原因［7］。血小板膜糖蛋白特異性抗體通過對血小板抗原特異性結(jié)合，進(jìn)一步破壞機(jī)體的血小板，降低機(jī)體的血小板數(shù)量，機(jī)體的凝血功能顯著障礙，最終導(dǎo)致出現(xiàn)臨床出血癥狀。

在本研究中，通過與健康人群比較，兒童免疫性血小板減少癥患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平顯著升高，在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GP Ⅱb/Ⅲa 主要通過對FC 途徑對患兒的血小板進(jìn)行清除，而GP Ⅰb/Ⅸ抗體水平則不通過FC 途徑對患兒的血小板進(jìn)行清除，其主要通過對機(jī)體的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的激活，進(jìn)而引發(fā)患兒的血小板的聚集以及凋亡［8］。在疾病進(jìn)展過程中，隨著患兒的疾病進(jìn)展，其血小板計數(shù)顯著下降，出血程度顯著提升［9］，有研究指出［10］，在機(jī)體的血清中，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ不僅可直接通過對患兒的血小板作用，同時，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ與機(jī)體的血小板抗原的結(jié)合，進(jìn)而形成復(fù)合物，影響患兒的血液纖維程度，參與血小板的黏附以及聚集［11］。GP Ⅰb/Ⅸ作為血小板的血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）的重要受體，進(jìn)而有效降低患兒的血小板黏附作用［12］。而本研究中，通過對患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ與疾病進(jìn)展程度的分析，隨著患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ顯著性升高，患兒的出血傾向呈現(xiàn)顯著升高趨勢。張穎等［13］通過對免疫性血小板減少癥的疾病進(jìn)展與血小板膜糖蛋白特異性抗體的相關(guān)性分析，患兒的治療效果與血小板膜糖蛋白特異性抗體呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與本研究相互印證。

另外通過對患兒的預(yù)后進(jìn)行分析，隨著患兒的血小板膜糖蛋白特異性抗體的顯著性下降，患兒的臨床出血癥狀顯著性下降。分析認(rèn)為，隨著血小板膜糖蛋白特異性抗體水平的下降，其血液的纖溶系統(tǒng)以及血小板計數(shù)顯著改善［14］，患兒的臨床出血傾向顯著降低。付盼等通過對兒童原發(fā)性血小板減少癥患兒的預(yù)后分析中，血小板計數(shù)的峰值水平可作為患兒預(yù)后的重要預(yù)測因素［15］。但是血小板的峰值的測定需要一定的時間，對于臨床檢測不夠及時，而通過對患兒的血小板膜糖蛋白特異性抗體的診斷，對于臨床診斷以及預(yù)后判斷的及時性均具有積極的意義。本研究通過對患兒的聯(lián)合診斷效能和進(jìn)行分析，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ的聯(lián)合診斷靈敏度顯著高于單獨(dú)檢測，通過ROC 曲線分析，在對兒童免疫性血小板減少癥診斷中，GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ的臨界值分別為0.47，0.55，此臨界值對于患兒的臨床診斷具有重要參考。

圖1 GPⅡb/Ⅲa以及GPⅠb/Ⅸ聯(lián)合診斷對兒童免疫性血小板減少癥診斷效能分析

但是本研究還存在一定的局限性，由于樣本量較小，在對患兒的診斷效能的分析存在一定的局限性，有待在日后的研究中進(jìn)行。

兒童免疫性血小板減少癥的血小板膜糖蛋白特異性抗體顯著高于健康者，且隨著患兒的疾病進(jìn)展，患兒血小板膜糖蛋白特異性抗體GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ顯著升高，未來可通過對患兒的GP Ⅱb/Ⅲa 以及GP Ⅰb/Ⅸ水平檢測，對患兒的治療效果進(jìn)行預(yù)測。