不同程度頸動脈狹窄對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

向入平，陳 瓊，崔 嶸，余輝云，周美君，李 枝，黃玉涓，余 成

（湖南師范大學(xué)附屬長沙醫(yī)院/長沙市第四醫(yī)院，長沙 410006）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率等特點，是目前人類疾病主要死亡原因之一［1］?，F(xiàn)有研究表明，30%的缺血性腦卒中是由頸動脈狹窄（carotid artery stenosis，CAS）引起的［2］；頸動脈狹窄程度與缺血性腦卒中發(fā)生率呈正相關(guān)，常被作為卒中患者危險性的評估依據(jù)之一［3］。CAS 可以導(dǎo)致IS 發(fā)生，但目前關(guān)于CAS 對腦缺血再灌注損傷的影響及作用機制尚不清楚，本研究通過建立不同程度大鼠頸動脈狹窄缺血再灌注模型，通過觀察缺血再灌注后缺血半暗區(qū)病理、神經(jīng)細胞凋亡和XIAP、Smac 蛋白表達的變化，探討不同程度頸動脈狹窄對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響及其機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與實驗試劑 SPF 級健康雄性SD 大鼠，8 周齡，體重260～310 g，均購自于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002。Smac 抗體和XIAP 抗體，均購自于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司?？俁NA 提取試劑盒購自于北京索萊寶科技有限公司；通用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Realtime PCR 熒光定量試劑盒均購自于上海翊圣生物科技有限公司。顯微鏡和成像系統(tǒng)購自于日本尼康公司。

1.2 動物模型的制備與實驗分組 參照Zhou［4］等的方法制備輕、中、重度頸動脈狹窄大鼠模型。大鼠于術(shù)前8～12 h 禁食，自由飲水，經(jīng)乙醚誘導(dǎo)麻醉，仰臥固定，頸正中去毛備皮消毒后，行頸正中切口2～3 cm，分離頸總動脈，在頸動脈近心側(cè)距頸內(nèi)動脈和頸外動脈分叉處約1.5 cm 平行放置0.45mm（輕度狹窄）、0.7 mm（中度狹窄）、0.9 mm（重度狹窄）不同直徑的注射用針頭，用0 號手術(shù)縫線結(jié)扎頸總動脈和針頭，然后小心拔出針頭剪斷絲線，縫合皮膚，肌注40 萬單位青霉素預(yù)防感染。建立頸總動脈狹窄模型，將造模大鼠分為輕度狹窄組、中度狹窄組、重度狹窄組。頸總動脈分離未結(jié)扎的大鼠作為對照組。

以上4 組大鼠，普通飼料喂養(yǎng)30 d。30 d 后，所有實驗大鼠參照Longa［5］等方法行大腦中動脈腦缺血-再灌注處理。用乙醚誘導(dǎo)麻醉大鼠，頸正中切口，分離頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，在頸外動脈距離頸動脈分叉處約17～18mm 處結(jié)扎，在結(jié)扎處的近端將頸外動脈離斷并反折致殘端與頸內(nèi)動脈呈一直線，用一根直徑為30mm 的鈍頭尼龍縫線自頸外動脈殘端向頸內(nèi)動脈緩緩插入，直到感覺到輕微的阻力不能進線時停止插線，將頸外動脈殘端及尼龍線栓一同結(jié)扎，記錄時間作為動脈阻塞開始時間，縫合傷口。在手術(shù)過程中，通過加熱燈監(jiān)測直腸體溫并保持在36.5～37.0℃之間，分別于阻塞12 h 和24 h 后取下尼龍縫線恢復(fù)血供。對照組、輕度狹窄組、中度狹窄組和重度狹窄組4 組大鼠根據(jù)動脈阻塞時間每組內(nèi)各又隨機分成12 h、24 h 兩個亞組，每個亞組入組大鼠5 只。恢復(fù)血供24 h 后對大鼠實施安樂死，取腦組織。

1.3 病理變化觀察 各組大鼠腦組織在4%多聚甲醛中固定12 h，將標(biāo)本包埋切片，切片厚度5μm，PBS 沖洗3 次，每次10 min，裝片。切片制備后，在68℃下蘇木精染色5min，鹽酸乙醇分化。將樣品用體積分數(shù)為1%的氨水還原成藍色，用伊紅染液染色，用自來水沖洗30 s，最后用酒精脫水。將用二甲苯封閉的切片置于×200 顯微鏡下觀察腦組織的病理變化。

1.4 神經(jīng)細胞凋亡檢測 腦組織切片準備好后，在3%過氧化氫溶液孵化5 分鐘，在100℃下0.05 mol / L檸檬酸溶液修復(fù)10 分鐘，15%脫脂奶粉封閉1 h。1：500 TUNEL 檢測溶液室溫下黑暗中孵化90 分鐘，37℃下1：500 熒光素抗體孵化60 分鐘，與PI 染色液反應(yīng)5 min，60℃干燥。最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。用 Image 軟件統(tǒng)計顯微鏡視野中亮綠光的凋亡細胞數(shù)，計算每個樣本細胞凋亡陽性率=陽性凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.5 XIAP、Smac 蛋白表達檢測 嚴格按照總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Realtime PCR 熒光定量試劑盒說明書中方法，用Trizol 從腦組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄總RNA，使用Hieff ? qPCR SYBR 在檢測系統(tǒng)中進行RT-qPCR。以2-ΔΔCt法（Livak 法）進行定量分析。

1.6 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準差表示，多組間比較采用單因素方差分析法。數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同程度CAS 對缺血半暗帶的形態(tài)學(xué)影響 對照組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，核仁清晰。輕度狹窄組、中度狹窄組和重度狹窄組梗死側(cè)腦組織疏松，細胞結(jié)構(gòu)紊亂、細胞空泡樣變、細胞核裂解、胞漿染色較深；且隨著狹窄程度的加重，腦損傷程度加深，胞漿染色加深，細胞核裂解加重；缺血再灌注時間越長，損傷程度亦越嚴重。結(jié)果見圖1。

2.2 不同程度的CAS 對缺血半暗區(qū)細胞凋亡的影響缺血再灌注12 h，重度狹窄組神經(jīng)細胞凋亡陽性率明顯高于對照組、輕度狹窄組、中度狹窄組（P＜0.05）；缺血再灌注24 h，較對照組，輕度狹窄組、中度狹窄組和重度狹窄組神經(jīng)細胞凋亡陽性率均明顯升高（P＜0.05）。同組間，缺血再灌注24 h 較12 h 神經(jīng)細胞凋亡陽性率均明顯升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2，表1。

2.3 不同程度CAS 對缺血半暗帶XIAP 和Smac 表達的影響 缺血再灌注12 h 和24 h，與對照組相比，中度狹窄組和重度狹窄組XIAP 表達均顯著上調(diào)（P＜0.05）。缺血再灌注24 h，不同程度頸動脈狹窄組間比較顯示，狹窄程度越重，XIAP 表達越高。同組間，缺血再灌注24 h 較12 h XIAP 表達均明顯升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

缺血再灌注12 h 和24 h，與對照組相比，中度狹窄組和重度狹窄組Smac 表達均顯著上調(diào)（P＜0.05）；不同程度頸動脈狹窄組間比較顯示，狹窄程度越重，XIAP表達越高。結(jié)果見表3。

3 討論

IS 病理過程的基本因素是血管狹窄或閉塞導(dǎo)致了局部腦組織血流量的下降，及時恢復(fù)血流供應(yīng)是IS 患者臨床治療的關(guān)鍵。但是，當(dāng)受阻血管再通或建立并開放側(cè)支循環(huán)恢復(fù)血流供應(yīng)后，腦組織損傷程度反而進一步加重，即“腦缺血/再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）”。本研究建立了大鼠不同程度頸動脈狹窄腦缺血再灌注模型，并與正常缺血再灌注大鼠進行比較，研究發(fā)現(xiàn)，頸動脈狹窄可加重腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡，且隨著頸動脈狹窄程度的加重，神經(jīng)細胞的破壞程度加重。這一結(jié)果提示在IS 的臨床防治中，需要密切關(guān)注頸動脈狹窄帶來的潛在危害，在腦缺血時不但要考慮及時恢復(fù)血液供應(yīng)，同時也應(yīng)該重視對神經(jīng)細胞的保護，從而減少再灌注后造成的繼發(fā)性損傷。

圖1 不同組別大鼠腦組織病理改變（HE染色，×200）

CIRI 的發(fā)生機制較為復(fù)雜，目前研究報道的主要有能量代謝障礙［6］、氧化應(yīng)激［7］、細胞凋亡［8］、炎癥反應(yīng)［9］等。其中，細胞凋亡不僅參與了CIRI 的過程，并與炎癥反應(yīng)、自由基損傷等目前已知導(dǎo)致CIRI 的其它作用機制密切相關(guān)［10］，是介導(dǎo)CIRI 主要的機制之一，能夠促進神經(jīng)功能損傷進行性發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，中度狹窄組和重度狹窄組神經(jīng)細胞凋亡陽性率明顯升高，說明中、重度CAS 可促進缺血半暗帶區(qū)細胞凋亡。

細胞凋亡的機制非常復(fù)雜，其中XIAP/Smac 信號的激活起著關(guān)鍵作用，XIAP 和Smac 是細胞凋亡途徑中的重要蛋白［11-12］。XIAP 被認為是迄今作用最強的內(nèi)源性Caspase 抑制因子，能通過抑制Caspase-3［13］、Caspase-7［13］、Caspase-9［14］等多種途徑發(fā)揮抗凋亡作用；而Smac 的表達增加能競爭性地與XIAP［15］、 c IAP1［16］等相互作用，解除XIAP 對Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 的抑制發(fā)揮促凋亡作用。Zhang［17］等研究發(fā)現(xiàn)Caspase9 與XIAP 在缺血半暗區(qū)通過轉(zhuǎn)亞硝化反應(yīng)相互作用，從而導(dǎo)致細胞凋亡；Siegelin［18］等和Saito［19］等發(fā)現(xiàn)在小鼠局灶性腦缺血再灌注和大鼠海馬腦缺血再灌注后，Smac 的合成增加，提示Smac 參與了腦缺血后神經(jīng)元的死亡過程；Lotocki［20］等研究表明，抑制XIAP/Smac 信號通路的活性可以減緩缺血再灌注對缺血半暗區(qū)的損傷；這些結(jié)果與我們的發(fā)現(xiàn)相似。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注12 h和24 h，中度和重度狹窄組缺血半暗區(qū)XIAP 和Smac的表達顯著上調(diào)，且隨著CAS 程度加重，XIAP 和Smac的表達越高。由此可見，CAS 可誘導(dǎo)XIAP/Smac 信號通路的激活，從而啟動細胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，CAS 能加重腦缺血再灌注損傷，且隨著狹窄程度的加重和再灌注時間的延長，損傷進一步加重；其機制與激活XIAP/Smac 信號通路，誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。因此，密切關(guān)注頸動脈狹窄的潛在危害，及時恢復(fù)再灌注的同時對神經(jīng)細胞加以保護是臨床防治急性缺血性腦損傷的關(guān)鍵。CAS 介導(dǎo)腦缺血再灌注損傷加重的機制是否還與能量代謝、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等其他途徑有關(guān)，有待進一步深入研究，以期為IS 的臨床防治提供更豐富的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

圖2 不同組別大鼠腦組織細胞凋亡陽性率檢測（TUNEL染色，×400）

表1 不同組別大鼠細胞凋亡陽性率（%）

表2 不同組別大鼠缺血半暗區(qū)XIAP蛋白表達

表3 不同組別大鼠缺血半暗區(qū)Smac蛋白表達