間接免疫熒光法與免疫印跡法聯(lián)合檢測2967份血清自身抗體結(jié)果分析

段玲，鄧德耀，黃興鳳，高宗鷹，江河，韓明勇，顧津伊，龍湖波，呂紅玲

(云南省第二人民醫(yī)院 檢驗科，云南 昆明 650000)

0 引言

自身免疫性疾病(autoimmune disease，AID)是由于機體免疫系統(tǒng)受環(huán)境或遺傳等因素作用，使自身免疫耐受遭到破壞，產(chǎn)生針對自身正常或變性的組織、器官、細(xì)胞、蛋白質(zhì)或酶類等自身抗原的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致對自身組織或器官損傷或功能障礙。當(dāng)發(fā)生自身免疫性疾病時，機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了針對自身成分的自身抗體。近年來研究表明，抗核抗體與自身免疫性疾病之間有著密切的聯(lián)系[1]?？购丝贵w檢測是自身免疫性疾病的重要標(biāo)志，目前臨床實驗室中檢測自身抗體的方法主要有：間接免疫熒光法(IIF)、抗核抗體譜免疫印跡法(LIA)、酶聯(lián)免疫法(ELSIA)、雙向免疫擴散(RID)和放射免疫技術(shù)(RIA)等。本研究探討聯(lián)合使用IIF-ANA與LIAANAs檢測自身抗體，分析兩種檢測方法結(jié)果間的相關(guān)性及對AID診斷的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 基本資料

收集我院住院期間疑似或確診為自身免疫性疾病2967份血清標(biāo)本，靜置30min后，離心分離血清(轉(zhuǎn)速：3000r/min，離心時間3分鐘)。離心分離后的血清標(biāo)本同時采用IIF檢測ANA及LIA檢測ANAs，當(dāng)日不能及時檢測的血清放2℃—8℃冰箱保存。

1.2 方法

IIF檢測ANA，采用德國歐蒙實驗室診斷有限公司生產(chǎn)的間接免疫熒光試劑盒，每次實驗過程中均設(shè)陰、陽性對照，實驗過程嚴(yán)格按照試劑盒提供的說明書及本實驗室的操作規(guī)程(SOP文件)進行，采用尼康50i熒光相差顯微鏡觀察結(jié)果，根據(jù)細(xì)胞或組織內(nèi)特異性熒光將熒光模型判為：著絲點型、胞漿顆粒型、核顆粒型、核仁型、肌動蛋白、波形蛋白、均質(zhì)型、核點型、核周型、中心粒等。檢測滴度分為：＜1：100、1：100、1：320、1：1000、1：3200及＞1：3200。LIA檢測ANAs，采用德國歐蒙免疫印跡法試劑盒(抗核抗體譜15項)，可檢測抗RNP、抗SM、抗SSA、抗SSB、抗JO1、抗SCL70、抗著絲點B蛋白、抗核小體、抗組蛋白、抗P蛋白、dsDNA抗體、AMA-M2等15種抗體，實驗過程嚴(yán)格按照試劑盒提供的說明書及本實驗室操作規(guī)程(SOP文件)進行。

2 結(jié)果

2967份血清樣本同時采用IIF與LIA法檢測，IIF檢測陽性率16.35%(485/2967)，LIA檢測陽性率11.53%(342/2967)，兩種方法檢測總陽性率為17.32%(514/2967)，IIF檢測敏感性較好；兩種方法檢測均陽性共313例，符合率是10.55%(313/2967)；IIF陽性而LIA陰性時為5.8%(172/2967)，LIA陽性而IIF陰性時為0.98%(29/2967)。見表1。

表1 IIF與LIA兩種方法同時檢測抗核抗體的結(jié)果比較

342例LIA陽性標(biāo)本，表現(xiàn)出不同的特異性抗體，主要表現(xiàn) 為：抗SSA37.67%(217/576)，抗AMA-M212.5%(72/576)，抗SSB抗體10.76%(62/576)，其余均低于10%。其中29例IIF檢測抗核抗體滴度＜1：100的標(biāo)本，其LIA亦檢測出不同的特異性抗體，主要為抗SSA抗體14例38.89%(14/36)，抗AMA-M2抗體10例27.78%(10/36)，抗SM、抗SSB、抗P蛋白抗體分別各2例5.56%(2/36)，抗Jo1、抗著絲點B蛋白、抗核小體各1例2.78%(1/36)，表明若單獨只用IIF檢測抗核抗體，易造成以抗SSA、抗AMA-M2為主要陽性抗體的標(biāo)本漏檢。本組數(shù)據(jù)還顯示LIA檢測陽性率與IIF檢測熒光強度無明顯的正負(fù)相關(guān)性。在IIF1：320時LIA檢出的抗體陽性數(shù)最多，這可能與在此滴度收集到的標(biāo)本數(shù)量最大有關(guān)。見表2。

表2 不同滴度下IIF-ANA標(biāo)本中LIA-ANAs的檢測結(jié)果(n=342)

2967例血清標(biāo)本中，IIF、LIA同時檢出陽性標(biāo)本共313例，其中當(dāng)熒光模型表現(xiàn)為核顆粒型時，對應(yīng)的特異性抗體主要有：抗SSA42.17%(194/460)，抗SSB12.83%(59/460)，抗RNP10.87%(50/460)；胞漿顆粒型：抗SSA 33.22% (96/289)，抗AMA-M217.99%(52/289)，抗P蛋白抗體9.69%(28/289)；著絲點型：著絲點B蛋白抗體62.75%(32/51)，抗AMA-M219.61(10/51)，抗SSA7.84%(4/51)；核仁型：抗SSA40%(16/40)，抗SSB17.5%(7/40)，抗P蛋白抗體15%(6/40)，此表明熒光模型核顆粒型與抗SSA抗體、抗SSB抗體；著絲點型與抗CENP-B抗體；胞漿顆粒型與抗AMA-M2抗體有較高相關(guān)性，這與文獻[2]研究基本一致。各特異性抗體總檢出率抗SSA抗體36.48%(313/858)，抗AMA-M2抗體11.54%(99/858)，抗SSB抗 體11.19%(96/858)，其 余 均 低 于10%。見表3。

表3 IIF-ANA的熒光模型與LIA-ANAs抗體之間相關(guān)性(n=313)

3 討論

自身免疫性疾病的發(fā)病率占世界總?cè)丝诘?%-5%，已成為嚴(yán)重影響人類健康的疾病，自身抗體檢測對AID診斷和鑒別診斷、病情評估與治療監(jiān)測、病程轉(zhuǎn)歸與預(yù)后判斷等都具有重要的臨床應(yīng)用價值[2]，但在實際工作中發(fā)現(xiàn)，有時一些明確診斷為AID的患者，ANA篩查試驗結(jié)果為陰性，而部分篩查結(jié)果為陽性的，最后診斷為非AID患者[3-4]。抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)是一組將自身各種細(xì)胞核成分作為靶抗原的自身抗體的總稱，主要是IgG，也有IgM、IgA和IgD，無器官和種屬特異性，故該類抗體可與所有動物的細(xì)胞核發(fā)生反應(yīng)。IIF檢測ANA時最常用核質(zhì)豐富的培養(yǎng)細(xì)胞HEP-2細(xì)胞作為抗原，針對整個細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期等成分抗體進行檢測，通過其熒光模型進行判讀，其靈敏度相對更高[5-7]，且具有檢測操作方便、檢測范圍廣的特點。但IIF對檢測AID特異性相對較低，檢測自動化程度低，操作標(biāo)準(zhǔn)化較難[8]。LIA法可選擇不同的組合一次檢測多種特異性抗體，該法有操作簡便快捷、結(jié)果判讀方便、易自動化等優(yōu)點，但目前LIA只能檢測有限的15種抗體，特異性強，但靈敏度低。

本研究通過對2967份應(yīng)臨床需要送檢血清標(biāo)本中自身抗體檢測結(jié)果進行回顧性分析，分析研究表明IIF檢測的敏感性較好，但仍存在部分假陰性，假陰性占0.98%。文獻表明與HEP-2細(xì)胞為抗原基質(zhì)檢測自身抗體時，由于抗原分布不均、含量低以及不同方法對特定抗原的破壞等因素的影響有關(guān)，導(dǎo)致IIF存在一定的假陰性[9]。另外IIF檢測方法采用的二抗是抗IgG的抗體，而抗核抗體主要是IgG，也有IgM、IgA和IgD，對后三種抗體的忽略也可能是造成IIF漏檢的原因之一[10]。IIF陽性而LIA陰性占5.8%，IIF陰性而LIA陽性占0.98%，LIA假陰性率高于IIF法，LIA檢測抗核抗體具有較高的特異性，但目前免疫學(xué)所能檢測的抗核抗體種類有限，僅為自身抗體中一小部分，仍有大量的未知特異性抗體未被認(rèn)識或未應(yīng)用于臨床檢測。臨床實驗中提高LIA的檢出率，更多的可提取性核抗原的提取對自身免疫性疾病的臨床意義不可忽略。

單純用IIF檢測，易造成LIA檢測抗SSA抗體、抗AMA-M2抗體陽性的標(biāo)本漏檢；而抗SSA抗體對SLE和亞急性皮膚型SLE的診斷具有重要意義。國內(nèi)外也有許多報道證實ANA陰性亞型SLE患者的存在，原因可能是此類患者體內(nèi)因抗體被受累組織結(jié)合或應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等導(dǎo)致ANA陰性[11]。實際應(yīng)用中，IIF檢測針對整個細(xì)胞核，線粒體型抗體分為很多型，而LIA檢測僅針對AMA-M2型抗體，所以易造成AMA-M2在IIF中的漏檢。有研究表明，臨床疑似RA、PM、DMM等疾病的患者，即使IIF篩查陰性，亦應(yīng)用LIA法檢測抗SSA特異性抗體，以提高基本的檢出率[12]。

本研究還表明LIA檢出率與抗體滴度無明正負(fù)相關(guān)性，并不是滴度越高檢出率越高。本組數(shù)據(jù)顯示在1：320滴度時檢出率較高，可能與在此滴度范圍收集的標(biāo)本量較大有關(guān)。本組研究中LIA檢測陽性的342例標(biāo)本提示，檢出的主要特異性抗體為：抗SSA37.67%(217/576)，抗AMA-M212.5%(72/576)，抗SSB抗體10.76%(62/576)，其余均低于10%?？筍SA抗體最常見于干燥綜合癥、SLE及原發(fā)性膽汁性肝硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性肌炎，偶見于慢性活動性肝炎，抗SSB抗體可出現(xiàn)在干燥綜合癥、SLE患者血清中，在干燥綜合癥中抗SSA、抗SSB常同時出現(xiàn)[13,14]；高滴度的AMA-M2抗體是原發(fā)性膽汁性肝硬化的標(biāo)志，但在慢性肝臟疾病、進行性系統(tǒng)性硬化癥中也可陽性。這部分抗體LIA檢測的陽性率較高，但是對AID診斷的特異性不強[15]。

IIF、LIA檢測同時陽性的313例標(biāo)本中，熒光模型表現(xiàn)為核顆粒型時，主要見抗SSA抗體42.17%，抗SSB抗體12.83%，抗RNP抗體10.87%；胞漿顆粒型：抗SSA抗體33.22%、抗AMA-M2抗體17.99%，抗著絲點P蛋白9.69%；著絲點型：著絲點B蛋白抗體62.75%，抗AMA-M2抗體19.61%，抗SSA抗體7.84%；核仁型：抗SSA抗體陽性40%，抗SSB抗體17.50%，抗著絲點P蛋白15%。核顆粒型、胞漿顆粒型、核仁型LIA檢測陽性的特異性抗體主要為：抗SSA，抗AMA-M2，抗SSB抗體，著絲點型主要表現(xiàn)為著絲點B蛋白抗體陽性，表明IIF熒光模型與LIA特異性抗體之間有一定的關(guān)系，但沒有絕對的規(guī)律可尋，不能通過分析熒光模型判斷相應(yīng)的特異性抗體。

綜上所述，IIF檢測表現(xiàn)出較高的陽性檢出率但對AID特異性低，而 LIA檢測ANAS時存在較高的假陰性，兩者存在一定的相關(guān)性又各有差異。一種自身免疫性疾病有多重自身抗體，IIF和LIA兩者聯(lián)合檢測可提高檢出率，降低漏檢率，兩種方法不可相互取代，臨床中聯(lián)合檢測對自身免疫性疾病的診斷、病情監(jiān)測及預(yù)后判斷具有重要的臨床意義。