四逆湯對阿霉素誘導的慢性心力衰竭大鼠內質網(wǎng)應激的影響

于游， 杜瑩， 南明花， 李佳， 張妤， 呂美君， 王瑩， 吳瑾， 孫紅

（1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，遼寧沈陽 110034）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多種心血管疾病的終末階段，具有較高死亡率。對心力衰竭機制的研究始終是心血管領域研究的重要內容。近年來，內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是CHF 機制和治療靶點[1]研究的熱點，氧化應激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、缺血等各種因素刺激均可導致ERS 的發(fā)生。目前針對CHF 患者暫無根治措施，臨床主要以對癥治療、改善心功能和提高生活質量為主[2]。四逆湯為中醫(yī)回陽救逆的代表方劑，現(xiàn)代研究表明，其具有強心、保護心肌、保護血管、免疫調節(jié)及抗休克等作用[3]，且對心血管疾病的治療作用在臨床中也得到證實[4]。本研究通過腹腔注射阿霉素的方法建立CHF大鼠模型，觀察四逆湯對阿霉素誘導的CHF 大鼠ERS 的影響，探討四逆湯治療CHF 的分子機制，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及飼養(yǎng)方法 SPF級12周齡健康雄性SD大鼠90 只，體質量（220±20）g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，動物質量合格證號：SCXK（遼）2015-0001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心，自由進食飲水。動物飼養(yǎng)及實驗方案遵循國家《實驗動物管理條例》并通過遼寧中醫(yī)藥大學倫理委員會審查。

1.2 藥物、試劑與儀器 四逆湯的中藥組成：附子10 g、干姜6 g、炙甘草4 g。以上中藥材顆粒購自遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號分別為18110511、18101401、19010031），每裝0.5 g，相當于飲片3 g。鹽酸曲美他嗪片（萬爽力），20 mg/片，由施維雅（天津）制藥有限公司生產(chǎn)（國藥準字H20055465，批號：2014557）。鹽酸阿霉素，25 mg/支，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)，批號：1114H022；大鼠腦鈉肽（BNP）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司；SYBR Green Master Mix熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒由大連TaKaRa 公司提供（批號：DRR047A）；TRIzol 試劑由大連TaKaRa 公司提供（批號：DRR820A）。7500實時熒光定量PCR儀（美國Life 公司）；Vevo2100 超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)（加拿大VisualSonics公司）；SpectraMaxi3多功能酶標儀（美國MD公司）；ST16R型冷凍高速離心機、 Wellwash Versa 多功能高效洗板機、Nano2000 超微量紫外分光光度計（德國Thermo 公司）。

1.3 動物分組、模型制備與給藥 取90只大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機選取15 只作為正常組，其余大鼠腹腔注射阿霉素（濃度2 mg/mL）2 mL/kg，每周1次，共6周，制備CHF模型[5-6]，同期正常組給予腹腔注射等體積生理鹽水。造模結束后，正常組大鼠全部存活，造模大鼠存活60只。再將60只CHF大鼠按隨機數(shù)字表分為5組，即模型組，四逆湯低、中、高劑量組，曲美他嗪組，每組12 只。四逆湯低、中、高劑量組按包裝上推薦的每克顆粒折算成的飲片量來調配每種藥物，根據(jù)人與動物等效關系[7]分別給予1.4、4.2、12.6（生藥）g·kg-1·d-1灌胃，容積均為2 mL/只；曲美他嗪組根據(jù)人與動物等效關系[7]給予曲美他嗪10 mg·kg-1·d-1灌胃；正常組和模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥4周。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 心功能檢測 將大鼠誘導麻醉后，將鼻子置于鼻套中，吸入體積分數(shù)2%異氟烷氣（異氟烷∶氧氣=2∶1），仰臥位固定。待翻正反射消失，用脫毛膏胸部脫毛備皮，涂耦合劑，將小動物超聲探頭（250 MHz）置于大鼠左前胸，進行超聲檢查。測量左心室舒張末期直徑（LVEDD）、左心室射血分數(shù)（LVEF）和左心室縮短分數(shù)（LVFS）。

1.4.2 血漿BNP和AngⅡ檢測 大鼠末次給藥后，禁食12 h，于次日給予100 g/L水合氯醛3 ～4 mL/kg麻醉，腹主動脈取血，肝素抗凝，靜置1 h，以3 000 r/min 離心20 min，分離上清，采用ELISA 法檢測BNP和AngⅡ的含量，具體步驟按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 實時PCR法檢測心肌組織葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）、RNA 依賴的蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶（PERK）及活化轉錄因子4（ATF4）mRNA 表達 應用Premier 5.0 軟件設計PCR 引物，由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。GRP78 上游引物序列為5’-TAATCAGCCCACCGTAAC-3’，下游引物序列為5’-GTTTCCTGTCCCTTTGTC-3’，擴增長度193 bp；PERK 上游引物序列為5’-CTCAGTGCATATAGTG GAAA-3’，下游引物序列為5’-ATGTCTGGAATA TACCGAAG-3’，擴增長度203 bp；ATF4 上游引物序列為5’-ATGACCGAAATGAGCTTCCTG-3’，下游引物序列為5’-GCTGGAGAACCCATGAGGT-3’，擴增153 bp；GAPDH 上游引物序列為5’-GT CGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物序列為5’-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3’，擴增長度181 bp。取心肌組織，用TRIzol 提取總RNA，逆轉錄，設定PCR 反應條件，初始變性（95 ℃，3 min），進行PCR 反應，進而進行40 個循環(huán)的變性（95 ℃，15 s）、退火（60 ℃，30 s）和延伸（72 ℃，30 s）。重復檢測3次。采用2-△△CT法對待測基因進行相對定量分析。

1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。先行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布采用單因素方差分析進行組間比較，不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 造模大鼠一般狀態(tài)觀察 造模大鼠存活率為66.7%。觀察發(fā)現(xiàn)，應用阿霉素造模第3周后，大鼠陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡，進食、進水量減少，活動量下降，體質量增長緩慢或下降，腹水，口唇及足趾發(fā)紺等CHF的癥狀。

2.2 各組大鼠心功能比較 表1 結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠左心功能明顯降低，表現(xiàn)為LVEDD 顯著增大，LVEF、LVFS 均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；與模型組比較，各治療組LVEDD 降低，LVEF、LVFS 增加，其中，四逆湯高劑量組及曲美他嗪組LVEDD、LVEF的差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），四逆湯中、高劑量組及曲美他嗪組LVFS的差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），且四逆湯各劑量組LVEDD、LVFS、LVEF 與曲美他嗪組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。

2.3 各組大鼠血漿BNP 和AngⅡ水平比較 表2結果顯示：與正常組比較，模型組血漿BNP和AngⅡ含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組血漿BNP和AngⅡ含量均有不同程度降低，其中，四逆湯中、高劑量組及曲美他嗪組差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），且四逆湯各劑量組BNP、AngⅡ含量與曲美他嗪組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。

表1 各組大鼠心功能比較Table 1 Comparison of the heart function in various groups （±s）

表1 各組大鼠心功能比較Table 1 Comparison of the heart function in various groups （±s）

①P ＜0.01，與正常組比較；②P ＜0.05，③P ＜0.01與模型組比較，

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表2 各組大鼠血漿BNP和AngⅡ水平比較Table 2 Comparison of the plasma BNP and AngⅡlevels in various groups （±s，pg·mL-1）

表2 各組大鼠血漿BNP和AngⅡ水平比較Table 2 Comparison of the plasma BNP and AngⅡlevels in various groups （±s，pg·mL-1）

①P ＜0.01，與正常組比較；②P ＜0.05，③P ＜0.01，與模型組比較

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2.4 各組大鼠心肌組織GRP78、PERK、ATF4 mRNA表達水平比較 圖1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠心肌組織GRP78、PERK、ATF4 mRNA 表達量升高（P ＜0.01）；與模型組比較，各治療組心肌組織GRP78、PERK、ATF4 mRNA表達量降低，其中，四逆湯中、高劑量組及曲美他嗪組GRP78 的差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），四逆湯高劑量組及曲美他嗪組PERK、ATF4 的差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），且四逆湯各劑量組GRP78、PERK、ATF4 mRNA表達水平與曲美他嗪組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。

3 討論

慢性心力衰竭（CHF）是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段。近年來，研究CHF 的動物模型較多，如藥物所致心肌病模型、壓力超負荷模型等。阿霉素是一種高效、廣譜蒽醌類抗腫瘤藥物，常用于治療白血病、淋巴瘤等疾病，但由于明顯的心臟毒性，長期大量使用會引起充血性心力衰竭[8]，因此，在研究中經(jīng)常選用阿霉素注射來制備心力衰竭模型[9]。與其他方法比較，此造模方法具有操作簡單、死亡率較低、成模率相對較高等特點。本研究選用腹腔注射阿霉素來誘導CHF模型，3周后，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠精神萎靡，心功能減低，并在神經(jīng)內分泌系統(tǒng)等方面表現(xiàn)出對心肌的毒害，表明模型建立成功。

圖1 各組大鼠心肌組織GRP78、PERK及ATF4 mRNA表達水平比較Figure 1 Comparison of the mRNA expression levels of GRP78，PERK，ATF4 in cardiac muscle tissue of various groups（±s）

發(fā)生心力衰竭時，左室充盈壓和室壁張力的增高是引起B(yǎng)NP分泌增加的關鍵原因。前期研究[10]已證實，心力衰竭的嚴重程度與BNP 水平呈正相關。腎素-血管緊張素-醛固酮（RAAS）系統(tǒng)是人體神經(jīng)內分泌系統(tǒng)中的重要組成部分，其生物學效應主要是通過AngⅡ來實現(xiàn)[11]。正常條件下，AngⅡ有維持血管張力，興奮交感神經(jīng)的作用；在病理情況下，AngⅡ是導致心室重構的主要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠BNP和AngⅡ水平均升高，提示BNP和AngⅡ可以作為觀察心力衰竭嚴重程度的標志物之一。

已有越來越多的研究證據(jù)表明，ERS在多種心血管疾病的病理過程中起著重要的作用，如動脈粥樣硬化、缺血/再灌注損傷、缺血性心臟病等[12]。適度的ERS是細胞的一種自我保護機制，可修復內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，而嚴重或持續(xù)的ERS 則誘導促凋亡因子的表達和活化，從而介導心肌細胞的凋亡[13]。動物實驗和臨床研究表明，ERS啟動了細胞凋亡并參與CHF 的病理生理過程[14]。內質網(wǎng)分子伴侶GRP78 屬于內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的感受器，是ERS 的標志性蛋白[15]，過度的ERS會啟動內質網(wǎng)膜上3種跨膜蛋白（跨膜蛋白激酶1、雙鏈RNA 依賴的PERK和活化轉錄因子6）介導的3條信號通路誘導細胞凋亡。PERK 通路是內質網(wǎng)應激的最重要通路，同時也是ERS 發(fā)生時最先啟動的通路[16]。PERK/ATF4 通路是內質網(wǎng)應激時發(fā)揮關鍵作用的通路，在許多慢性疾病的發(fā)生過程中起著尤為重要的作用[17]。ERS 狀態(tài)時，GRP78 從PERK 上解離并且大量表達，PERK通過自身磷酸化，進一步激活下游一系列反應同時上調ATF4，進而激活生長停滯及損傷基因誘導細胞凋亡[18]，從而導致CHF的發(fā)生。本研究結果顯示，CHF 模型大鼠心肌組織中與內質網(wǎng)應激相關的GRP78、PERK 及ATF4的mRNA 表達量顯著增多，表明CHF 的發(fā)生與ERS的PERK通路有關。

中醫(yī)學并無“心力衰竭”病名，臨床上將其歸屬于“心悸”“水腫”“喘證”等范疇。本病多因心氣或心陽虛衰，氣血津液運行不暢，導致痰濁、血瘀、水飲互結為病。中藥具有多組分、多途徑、多環(huán)節(jié)和多靶點的特點，在CHF 治療與控制進展上具有獨特的優(yōu)勢。四逆湯出自張仲景《傷寒論》，原文記載：“脈浮而遲，表熱里寒，下利清谷者，四逆湯主之?！痹摲接筛阶印⒏山透什?味中藥組成，用于少陰病之四肢厥逆、脈沉微細、神疲欲寐、惡寒倦臥及腹痛下利等陽氣虛衰諸癥[19]，為回陽救逆之代表方劑。方中：附子大辛大熱，溫腎壯陽，回陽救逆，其性走而不守，為君藥；干姜守而不走，溫中散寒，與附子相配，一走一守，加強破陰復陽之功，屬臣藥；伍以炙甘草，一方面可益氣溫中，調和諸藥，另一方面制約附子、干姜劫陰之弊，以防迅發(fā)而致虛陽暴脫，為佐使藥。三藥相合，揚長避短，共奏回陽救逆之效?，F(xiàn)代藥理研究也證實，三藥單味均有保護心肌細胞改善心功能的作用[20-21]，尤其附子，具有增強心肌收縮力、增加冠脈血流量、抗心肌缺血和抗休克等效應[22]。本研究結果顯示，經(jīng)四逆湯或曲美他嗪治療后，阿霉素誘導的CHF 大鼠心功能、BNP和AngⅡ水平均明顯改善，心肌組織中與內質網(wǎng)應激相關的GRP78、PERK 及ATF4 的mRNA表達量顯著降低，且2藥治療效果無明顯差異，表明四逆湯可有效改善大鼠CHF，其機制可能與抑制內質網(wǎng)應激PERK/ATF4通路有關。

綜上所述，本研究結果在一定程度上說明心力衰竭時會出現(xiàn)ERS 反應，四逆湯可抑制ERS 誘導的相關通路，增強內質網(wǎng)蛋白折疊能力，調節(jié)內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮抗心力衰竭的作用，可為中藥發(fā)現(xiàn)預防和治療心力衰竭的新靶點提供參考和依據(jù)。