茯磚茶金花發(fā)酵劑的制備工藝優(yōu)化

曹 霞， 劉永翔， 黃永會， 任錫毅， 鄒 曉， 譚玉梅*

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院， 山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室， 山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】茯磚茶(Fuzhuan Brick Tea)屬于一種后發(fā)酵黑茶，具有獨特的品質(zhì)和風(fēng)味，至今已有超過600年的悠久歷史，產(chǎn)銷量在黑茶市場中占據(jù)著重要的地位[1]。茯磚茶具有健胃消食、降脂減肥、降血壓等多種保健功效[2-4]。肖文軍等[5-7]研究表明，茯磚茶具有降脂減肥的作用。黃群等[8]研究表明，茯磚茶對人體胃腸消化功能具有調(diào)理作用。茯磚茶因具有較多的保健功效和投資價值，越來越受商業(yè)人士的青睞[9]。茯磚茶制作流程包括黑毛茶制備、渥堆、氣蒸、二次渥堆、發(fā)花干燥和成品包裝等[10]。形成茯磚茶品質(zhì)的最關(guān)鍵工藝是發(fā)花，該工藝是金花菌—冠突曲霉在茶葉中繁殖代謝的過程，該過程不僅能夠改善茶葉的外觀、色澤、香氣及口感等，還能夠產(chǎn)生對人體有益的活性代謝產(chǎn)物[11]。因此，金花菌的數(shù)量和顆粒的飽滿度是決定發(fā)花品質(zhì)的重要參數(shù)之一[12]。貴州的夏秋茶資源豐富，黑茶產(chǎn)業(yè)具有良好的發(fā)展前景，目前，貴州對黑茶的研究很少，且產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一，貴州黑茶企業(yè)普遍存在發(fā)花周期短，發(fā)花過程容易污染，發(fā)花工藝不成熟，沒有統(tǒng)一的制作標(biāo)準(zhǔn)等問題。有研究發(fā)現(xiàn)，人工接種可以改善茯磚茶品質(zhì)，而金花菌發(fā)酵劑的制備是人工接種的關(guān)鍵。對茯磚茶金花發(fā)酵劑的制備工藝進(jìn)行研究，對改善茯磚茶品質(zhì)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，針對發(fā)花技術(shù)的改進(jìn)，大多數(shù)采用人工接種液體發(fā)酵劑、孢子液、孢子粉和添加誘發(fā)劑[13]，這些制作方法都相對比較復(fù)雜，不適宜工廠化推廣?！狙芯壳腥朦c】目前，大多數(shù)利用固體培養(yǎng)方法，該方法具有操作方便，儲存時間長等優(yōu)點。為此，采用固體培養(yǎng)方法，對茯磚茶金花發(fā)酵劑的制備進(jìn)行研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過單因素試驗設(shè)計考察不同含水量、接種量與蔗糖含量對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量的影響，并利用響應(yīng)面法對發(fā)酵劑的配方進(jìn)一步優(yōu)化，以期縮短發(fā)花時間提高發(fā)花孢子濃度，為茯磚茶的工藝改良和品質(zhì)提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：金花菌—冠突曲霉(Aspergilluscristatus)，由中國科學(xué)院菌種保藏中心和貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室共同保存，中國科學(xué)院菌株保藏號：CGMCC 7.193；黑毛茶由貴州過江龍生態(tài)黑茶(集團(tuán))有限公司提供。

5%NaCl MYA培養(yǎng)基：稱取酵母5 g、麥芽糖20 g、蔗糖30 g、NaCl 50 g、攪拌混勻，然后加瓊脂1.5～1.7 g，蒸餾水定容至1 000 mL，混勻，121℃滅菌20 min，取出冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

儀器設(shè)備：高壓滅菌鍋，日本TomyKogyo公司；超純水系統(tǒng)，Purelab公司；超凈工作臺、搖床、BSS300-WEI電子天平，德國賽多利斯；各種規(guī)格的移液槍，Eppendorf；常溫冰箱，海爾集團(tuán)；電熱恒溫培養(yǎng)箱、廣口瓶、燒杯等其他小型儀器均為國產(chǎn)儀器。

1.2 方法

1.2.1 金花菌孢子懸浮液的制備 將活化后的金花菌接種至5%NaCl MYA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d；在超凈工作臺上刮取冠突曲霉孢子，放入無菌三角瓶內(nèi)，倒入一定量的無菌水，放入適量滅菌的玻璃珠，150 r/min，震蕩30 min；過濾菌液，利用血球計數(shù)板計數(shù)，保存于4℃冰箱備用[14]。

1.2.2 單因素試驗 稱取10 g黑毛茶，裝于滅菌三角瓶內(nèi)，添加不同含水量(20%、24%、28%、32%、36%、40%)，蔗糖含量(0、1%、2%、3%、4%、5%)及接種量(160 μL、200 μL、240 μL、280 μL、320 μL、360 μL)；除考察因素外，其余條件均為含水量28%，蔗糖含量2%，接種量為240 μL，溫度28℃下培養(yǎng)10 d，取出，45℃烘干1 d，測量孢子量，確定各單因素最佳水平，3次重復(fù)。

1.2.3 金花菌發(fā)酵劑孢子濃度的測定 取1 g發(fā)酵劑，加入9mL無菌生理鹽水，150 r/min下震蕩30 min，2層紗布過濾，40 mL無菌水多次沖洗，將孢子液稀釋100倍。用血球計數(shù)板計數(shù)。

孢子數(shù)(個/g)=總孢子數(shù)/(5×25×104)×100，式中5×25×104為血球計數(shù)板的格子數(shù)，100為稀釋倍數(shù)。

1.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以含水量(A)、蔗糖含量(B)及接種量(C)為試驗因素，以孢子量為響應(yīng)面值，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗，其因素水平見表1。

表1 茯磚茶金花發(fā)酵劑制備的響應(yīng)面試驗因素及水平

1.4 統(tǒng)計分析

采用Excel和SPSS對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對金花發(fā)酵菌產(chǎn)孢量的影響

從圖1可知，不同含水量、蔗糖含量及接種量的金花發(fā)酵菌產(chǎn)孢量變化。

2.1.1 含水量 水分含量是影響茯磚茶發(fā)花的重要條件之一[15]。隨著含水量的增加，產(chǎn)孢量呈先增后減趨勢。當(dāng)含水量達(dá)32%時，其產(chǎn)孢量最大，為21.52×107個/g，比含水量為20%時高近10倍。說明含水量對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量的影響較大。

圖1 不同含水量、蔗糖含量和接種量的金花菌產(chǎn)孢量

2.1.2 蔗糖含量 蔗糖能為微生物提供能量及營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)蔗糖添加量為2%時產(chǎn)孢量最大，為19.13×107個/g，比沒有添加蔗糖的孢子含量高1倍多；當(dāng)蔗糖添加量為3%時，產(chǎn)孢量緩慢下降，為17.21×107個/g，說明適宜的蔗糖含量有利于孢子產(chǎn)量的提高，但當(dāng)蔗糖含量過大時，高濃度的蔗糖可能會形成一定的滲透壓，抑制菌絲的生長，影響產(chǎn)孢量[19]。

2.1.3 接種量 當(dāng)接種量為200 μL時，其產(chǎn)孢量為7.5×107個/g。接種量低時，孢子數(shù)較少，產(chǎn)孢量低。當(dāng)接種量為320 μL時，產(chǎn)孢量最大，為17.74×107個/g；當(dāng)接種量為400 μL時，發(fā)酵劑產(chǎn)孢量逐漸降低。這是由于當(dāng)接種量過大時，孢子數(shù)較多，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足微生物的需要，抑制了菌體的生長，因此產(chǎn)孢量呈下降趨勢[14]。

2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化茯磚茶金花發(fā)酵劑的制備工藝

2.2.2 不同因素的交互作用 當(dāng)?shù)雀呔€圖形呈橢圓形時交互作用顯著，呈圓形時交互作用不顯著。通過模型回歸方差分析表明，一次項A對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響不顯著(P=0.318 3)，而B(P=0.008 4)和C(P=0.005 7)對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響顯著；交互項AB(P=0.141 8)對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響不顯著，等高線接近圓形(圖2)； AC(P<0.000 1)及BC(P<0.000 1)對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響極顯著，等高線接近橢圓形(圖2)；二次項A2(P<0.000 1)、B2(P<0.000 1)及C2(P<0.000 1)對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響極顯著。由P值可知，各因素對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響的順序依次為接種量(C)>蔗糖含量(B)>含水量(A)。

表2 響應(yīng)面試驗各處理茯磚茶金花發(fā)酵劑的產(chǎn)孢量

圖2 不同因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.2.3 最佳條件的確定及驗證 在獲得非線性回歸模型后，為求得最大產(chǎn)孢量，所得回歸擬合方程各自變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，求得次方程得到最大產(chǎn)孢量最優(yōu)條件為A=0.005、B=0.025、C=0.046換算成實際值為含水量31.96%、蔗糖2.98%、接種量321.92 μL，預(yù)測的最大產(chǎn)孢量為27.36×107個/g。

將響應(yīng)面優(yōu)化后的發(fā)酵條件進(jìn)行3次驗證試驗，其產(chǎn)孢量分別為2.63×108個/g、27.6×107個/g和26.9×107個/g，與預(yù)測結(jié)果27.36×107個/g基本一致，表明該模型準(zhǔn)確性且實用性高，能夠預(yù)測產(chǎn)孢量。

3 討論

茯磚茶的發(fā)花工藝對茯磚茶的品質(zhì)至關(guān)重要，與傳統(tǒng)的自然發(fā)花相比，添加金花菌發(fā)酵劑能縮短散茶發(fā)花時間、有效抑制雜菌的生長。1991年，黃建安[16]將2種誘發(fā)劑YFJ1和YFJ2添加到茯磚茶中；2007年，楊秀芳等[17]將天然助花劑添加到茯磚茶中；2009年，張睿[18]發(fā)明了一款直投式紅茶菌發(fā)酵劑；2012年，呂嘉櫪等[19]發(fā)明了一種茯磚茶孢子粉；結(jié)果都發(fā)現(xiàn)對發(fā)花作用比較顯著，并有利于產(chǎn)品和品質(zhì)的改變，可以縮短發(fā)酵周期，且有降低雜菌的污染等作用。但由于在發(fā)花過程中外源物添加量過大，不適合工業(yè)化生產(chǎn)；2014年，羅冰[20]利用麩皮、碳源物質(zhì)及NaCl等物質(zhì)制備發(fā)酵劑；2018年，周國慶等[14]在前人研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化了培養(yǎng)基配方，以含水量、氯化鈉濃度及接種量制備液體培養(yǎng)基及對發(fā)花促進(jìn)效果較好等。但是每次接種都需要洗金花菌的孢子液，儲存時間也較短，不利于工廠化推廣。

制備發(fā)酵劑要嚴(yán)格控制無菌環(huán)境外，影響發(fā)酵劑的內(nèi)在因素也很多，其涉及到制備工藝的每個環(huán)節(jié)。其中含水量是影響發(fā)酵劑的重要條件之一，金花菌—冠突曲霉只有吸收了茶葉中的營養(yǎng)成分才能生長，營養(yǎng)和吸收都需要以水為介質(zhì)[21]；賈洪信等[22]研究散茶發(fā)花主要因素發(fā)現(xiàn)，蔗糖處理對發(fā)花有一定的影響，加糖直接提供了冠突曲霉的營養(yǎng)條件且有利于發(fā)花，但大規(guī)模生產(chǎn)中加糖，發(fā)花成本較高；接種量是影響散茶發(fā)花的一個重要指標(biāo)，歐陽梅等[23-25]在茯磚茶散茶發(fā)花的技術(shù)研究表明，菌液接種能提高發(fā)酵茶的有益菌數(shù)量，同時提高了茶葉的感官品質(zhì)，是提高發(fā)酵茶質(zhì)量和產(chǎn)量的有效途徑[13]。但直接用菌液接種有可能加大污染幾率、操作過程繁瑣以及需要大量的菌液。

在前人的研究基礎(chǔ)上，開發(fā)了新型發(fā)酵劑，通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵劑最優(yōu)配方。研究結(jié)果表明，茯磚茶金花發(fā)酵劑的最佳制備條件為以10 g黑毛茶為基質(zhì)，添加含水量31.96%、蔗糖含量2.98%、接種量321.92 μL，28℃條件下，培養(yǎng)10 d，該條件下的產(chǎn)孢量可達(dá)27.36×107個/g。

4 結(jié)論

直接用黑毛茶為基質(zhì)的發(fā)酵劑相對于利用麩皮等為基質(zhì)要簡單，使用便利、儲藏時間長且成本更低，優(yōu)化的工藝參數(shù)經(jīng)濟可行，孢子產(chǎn)量更高及發(fā)花品質(zhì)較好，更加適宜進(jìn)行工廠化推廣應(yīng)用，可為下一步茯磚茶散茶發(fā)花的工業(yè)生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。