蒲公英多酚提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

崔艷平 聶瑋 遲曉君 岳鳳麗 陳劍飛 范藝源 李雪麗 姚夢園

摘要：為研究蒲公英多酚的利用價值以及后續(xù)的開發(fā)，采用超聲波微波提取蒲公英超微粉中多酚，在單因素的基礎上，通過Box-Behnken和響應面法對提取多酚的工藝條件（包括乙醇體積分數(shù)、料液比、微波時間、超聲時間、超聲功率、微波功率、提取溫度）進行優(yōu)化，確定最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶45、微波時間3min、超聲時間60min、超聲功率240W、微波功率350W、提取溫度50℃，在上述條件下，多酚提取率是2.96%。結果表明，蒲公英多酚具有清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力，并對鐵的還原也有一定的作用。

關鍵詞：蒲公英超微粉;超聲波微波提取;多酚;工藝優(yōu)化;抗氧化活性

中圖分類號R284.2文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2021）08-0175-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.046

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

StudyonOptimizationofExtractionTechnologyandAntioxidantActivityofDandelionPolyphenols

CUIYan-ping1，NIEWei2，CHIXiao-jun1etal（1.SchoolofFoodScienceandEngineering，ShandongAgriculturalEngineeringCollege，Jinan，Shandong250100;2.ShandongModernCollege，Jinan，Shandong250100）

AbstractInordertostudytheutilizationvalueofdandelionpolyphenolsandsubsequentdevelopment，ultrasonicmicrowavewasusedtoextractpolyphenolsfromdandelionultrafinepowder.Onthebasisofsinglefactor，theprocessconditionsforextractingpolyphenols（includingethanolvolumefraction，solid-to-liquidratio，microwavetime，ultrasonictime，ultrasonicpower，microwavepower，extractiontemperature）wereoptimizedbyBox-Behnkenandresponsesurfacemethod.Theoptimalextractionprocesswasdeterminedtobe50%ethanolvolumefraction，1∶45solid-to-liquidratio，microwavetime3min，ultrasonictime60min，ultrasonicpower240W，microwavepower350W，extractiontemperature50℃.Undertheaboveconditions，theextractionrateofpolyphenolswas2.96%.TheresultsshowedthatdandelionpolyphenolshadtheabilitytoscavengeDPPHfreeradicalsandABTSfreeradicals，andalsohadacertaineffectonironreduction.

KeywordsDandelionsuperfinepowder;Ultrasonicmicrowaveextraction;Polyphenols;Processoptimization;Antioxidantactivity

蒲公英是中醫(yī)傳統(tǒng)的清熱解毒藥物，全草藥用價值很高，含有生物堿類、有機酸類和黃酮類等活性成分[1-2]。蒲公英性味甘，微苦、寒，歸肝、胃經，具有利尿、緩瀉、退黃疸、利膽等功效[3]。目前對蒲公英多酚的研究相對較少，該試驗采取超聲波微波對蒲公英多酚提取條件進行優(yōu)化，并對其抗氧化活性進行研究，為蒲公英的進一步開發(fā)利用提供技術依據。

1材料與方法

1.1試材蒲公英，打成粉后過300目篩。無水乙醇，分析純;95%乙醇，分析純;無水碳酸鈉，分析純;福林酚試劑;沒食子酸;DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）;VC（抗壞血酸）;ABTS;過硫酸鉀（K2S2O8），分析純;磷酸二氫鈉，分析純;磷酸氫二鈉，分析純;鐵氰化鉀，分析純;三氯乙酸，分析純;三氯化鐵，分析純。

1.2儀器與設備

CW130粉碎機，上海天祥·健臺制藥機械有限公司;KH-6HMTN微波農產品干燥殺菌設備，山東科弘微波能有限公司;XO-SM200超聲波微波組合系統(tǒng)，南京先歐儀器制造有限公司;TGL-16M臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;V5000型可見分光光度計，上海元析儀器有限公司;LE104E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1蒲公英超微粉的制備。

將粉碎后的蒲公英過80目標準篩。稱取過篩后的粉500g，在超微粉碎機風速為1.0～2.0m/s、超微粉碎機轉速3000r/min、粉碎時長20min、蒲公英粗粉含水量10%的條件下，將蒲公英粗粉進行粉碎，此時蒲公英大于300目的超微粉出粉率較高。

1.3.2蒲公英多酚的提取。

準確稱取2.0g蒲公英粉，加入乙醇溶液，放入超聲波微波組合系統(tǒng)中，在不同條件下提取蒲公英多酚。超聲波提取后放入離心機中，以3500r/min的速度離心10min，得到的上清液即為蒲公英多酚提取液。

1.3.3多酚含量測定。

測定方法選取福林酚法。對蒲公英多酚提取液進行稀釋，取1.00mL提取稀釋液，對福林酚試劑進行10倍稀釋后，取1.5mL稀釋液，再加入7.5%的碳酸鈉溶液2.5mL，室溫條件下暗室反應1h，在波長為765nm處測定其吸光度[4-5]。

1.3.4標準曲線的繪制。在100mL容量瓶中放置準確稱取的0.0100g沒食子酸標準品，然后用蒸餾水稀釋并定容至刻度，搖晃均勻，得到質量濃度為100μg/mL的沒食子酸標準溶液。洗凈7個10mL比色管，做上標記，按標記移取標準溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加入福林酚試劑1.5mL、7.5%碳酸鈉溶液2.5mL，蒸餾水定容，搖勻。將比色管置于黑暗環(huán)境中反應1h，于765nm處測其吸光度，平行3次，取平均值繪制標準曲線，得到線性回歸方程為Y=0.0105X+0.0125（R2=0.999），具有良好的線性關系[6-7]。

1.3.5蒲公英多酚提取工藝優(yōu)化（單因素試驗）。

根據文獻[8]得出，影響蒲公英多酚提取的因素有乙醇體積分數(shù)、料液比、微波時間、超聲時間、超聲功率、微波功率、提取溫度。

1.3.6抗氧化活性研究。

在提取多酚最佳工藝的基礎上，分別研究蒲公英多酚對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力以及還原鐵離子的能力。

1.3.6.1DPPH自由基清除能力的測定。

稱取8.0mgDPPH溶解于無水乙醇中，定容到200mL棕色容量瓶中，得DPPH溶液濃度為0.004mmol/L，避光保存，備用。

分別取0.01、0.03、0.05、0.07、0.09mg/mL的樣品溶液1mL，置于10mL比色管，加入3mLDPPH使用液，搖勻，在黑暗條件下室溫保存30min，在517nm波長處測吸光度?？瞻讓φ詹捎脽o水乙醇，平行3次，可求清除率的平均值。并以VC做陽性對照[9]。

DPPH自由基清除率=（1-Ai-AjA0）×100%（1）

式中，A0為1mL無水乙醇和3mLDPPH使用液的吸光度;Ai為1mL樣品溶液和3mLDPPH使用液的吸光度;Aj為1mL樣品溶液和3mL無水乙醇的吸光度。

1.3.6.2ABTS自由基清除能力的測定。

取7.4mmol/LABTS溶液0.2mL與2.6mmol/LK2S2O8溶液0.2mL混合，暗室反應12h，用無水乙醇稀釋50倍，在測得734nm處的吸光度為0.70±0.02的條件下，制得ABTS+使用液。取3.2mL使用液與95%乙醇0.8mL振搖10s以充分混合，靜置6min，測得734nm處的吸光度記為A0，取3.2mL使用液與樣品溶液0.8mL振搖10s以充分混合，靜置6min，測得734nm處的吸光度記為A[10]。

ABTS自由基清除率=A0-AA0×100%（2）

1.3.6.3鐵離子還原力的測定。

將多酚母液稀釋成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL不同濃度梯度的溶液。分別取1mL多酚樣液，加至10mL比色管中，加入1mLpH=6.6的磷酸鹽緩沖液和1mL質量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀溶液，在50℃條件下水浴保溫時間為20min，然后冷卻至室溫，加入1mL質量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液[11]，備用。另取若干10mL比色管，分別加入lmL上述多酚處理樣溶液、蒸餾水2mL和1mL質量分數(shù)為0.1%的三氯化鐵溶液，混勻，靜置10min，在700nm處測定吸光度，以吸光度大小表示還原力強弱，用VC做標準對照[12]。

2結果與分析

2.1蒲公英多酚提取單因素試驗

2.1.1乙醇體積分數(shù)。

為探索乙醇體積分數(shù)對多酚提取率的影響，固定料液比1∶40、微波時長2min、超聲時長30min、超聲功率270W、微波功率350W、提取溫度40℃，在乙醇體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%時提取蒲公英多酚，計算多酚提取率，結果如圖1所示。隨著乙醇體積分數(shù)的升高，提取率先上升后下降，多酚提取率達到最高時，乙醇體積分數(shù)為50%，提取率為1.65%。原因在于乙醇體積分數(shù)的增加使蒲公英多酚溶解增加，利于提取，提取率增大;隨著乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大，可能會使有機溶劑與蒲公英多酚極性差異變大，多酚提取率降低[13]。因此，選取乙醇體積分數(shù)50%為蒲公英多酚最佳提取條件。

2.1.2料液比。

為探索料液比對多酚提取率的影響，固定乙醇體積分數(shù)50%、微波時長2min、超聲時長30min、超聲功率270W、微波功率350W、提取溫度40℃，在料液比分別為1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g∶mL）時提取蒲公英多酚，計算多酚提取率，結果如圖2所示。隨著料液比的不斷升高，蒲公英多酚提取率先上升后下降，料液比為1∶45時，多酚提取率最高，為2.76%。分析原因可能是隨著提取液體積的增多，蒲公英多酚擴散的壓力差增大，更有利于溶解在提取液中，多酚提取率增大;繼續(xù)增大溶劑比例，壓力差變化不明顯，并且總體積增大導致多酚濃度降低不利于提取，因此采用1∶45的料液比作為蒲公英多酚最佳提取條件[14]。

2.1.3微波時間。為探索微波時間對多酚提取率的影響，固定乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶40、超聲時長30min、超聲功率270W、微波功率350W、提取溫度40℃，在微波時間分別為1、2、3、4、5min時提取蒲公英多酚，計算多酚提取率，結果如圖3所示。隨著微波時間的延長，蒲公英多酚提取率先上升后下降，提取率達到最高的微波時長為2min，多酚提取率為2.84%。分析原因可能是隨著時間的增長，有利于多酚物質的溶出，提取率升高，在2min時達到最佳提取率，超過2min后，體系溫度升高，多酚氧化分解，從而提取率下降[15]。因此，選取2min微波時間作為蒲公英多酚最佳提取條件。

2.1.4超聲時間。

為探索超聲時間對多酚提取率的影響，固定乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶40、微波時長2min、超聲功率270W、微波功率350W、提取溫度40℃，在超聲時間分別為30、40、50、60、70min時提取蒲公英多酚，計算多酚提取率，結果如圖4所示。隨著超聲時間的延長，提取率整體趨勢先上升后下降，多酚提取率最高為超聲時間60min時，提取率為2.63%。原因可能是隨著時間延長，提取越完全，提取率升高，在超聲時間60min時提取率達到最大值，超過60min后，時間越長，熱敏物質如乙醇揮發(fā)量增大，從而使得多酚提取率降低[16]。因此，60min的超聲時間是蒲公英多酚最佳提取條件。

2.1.5超聲功率。

為探索超聲功率對多酚提取率的影響，固定料液比1∶40、微波時長2min、超聲時長30min、乙醇體積分數(shù)為50%、微波功率350W、提取溫度40℃，在超聲功率分別為180、210、240、270、300W時提取多酚，計算多酚提取率，結果如圖5所示。隨著超聲功率逐漸升高，提取率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并在270W最高，提取率為2.89%。分析原因可能是超聲功率的增大使超聲波振動強度增大，能夠更徹底地將多酚溶于提取液中，在超聲功率270W時，提取率達到最大;提取率下降在于當功率增大時，被損壞的多酚化合物增多。因此，270W的超聲功率是蒲公英多酚最佳提取條件。

2.1.6微波功率。

為探索微波功率對多酚提取率的影響，固定料液比1∶40、微波時長2min、超聲時長30min、乙醇體積分數(shù)50%、超聲功率300W、提取溫度40℃，在微波功率分別為200、250、300、350、400W時提取多酚，計算多酚提取率，結果如圖6所示。隨著微波功率的逐步升高，提取率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，多酚提取率最高在微波功率為350W時，提取率為2.66%。微波輔助提取法是利用磁控管所產生的高頻率振動使蒲公英細胞內的分子相互碰撞、擠壓，從而使多酚類化合物快速浸出的方法[17]。分析原因可能是隨著微波功率的增大，會出現(xiàn)分子碰撞破壞細胞導致其他雜質溶于提取劑，多酚與雜質發(fā)生反應，致使多酚含量降低，提取率下降。因此，選取350W為蒲公英多酚最佳提取條件。

2.1.7提取溫度。

為探索提取溫度對多酚提取率的影響，固定料液比1∶40、微波時長2min、超聲時長30min、乙醇體積分數(shù)50%、超聲功率300W、微波功率350W，在提取溫度分別為30、40、50、60、70℃時提取多酚，計算多酚提取率，結果如圖7所示。由圖7可知，提取溫度升高，多酚提取率先上升后下降;多酚提取率達到最高時提取溫度為50℃，提取率2.90%。分析原因可能是溫度的升高使分子運動加快，相同條件下多酚溶解更多，30～50℃多酚提取率逐漸增大，而隨著提取溫度的增加，多糖等有機物雜質增多，提取率下降。因此采用微波提取溫度40℃作為蒲公英多酚最佳提取工藝[18]。

2.2響應面試驗

2.2.1響應面設計及結果。

結合單因素試驗，根據Box-Behnken的原理[19]，利用響應面探究微波時間、提取溫度、超聲功率對蒲公英多酚提取的影響，固定乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶45、超聲時間60min、微波功率350W。該試驗共含中心點5個和試驗點17個。響應面優(yōu)化條件見表1，設計方案結果見表2。

2.2.2二次回歸模型擬合及模型分析。利用響應面對試驗數(shù)據進行回歸擬合，得到多酚得率的多項回歸模擬方程為Y=2.870+0.030A-0.004B-0.021C-0.083AB+0.013AC+0.000BC-0.190A2-0.140B2-0.240C2。由表3可知，此試驗結果F值（27.29）較高和P值（0.0001）較低，表明該模型具有極顯著差異。失擬項的F值為5.97，P值為0.0585，說明失擬不顯著，即該模型的擬合性良好。該模型的R2Adj為0.9367>0.80，說明此模型至少可以解釋93.67%的響應值變化。R2=0.9723，說明實際值與方程預測值的相關性良好。信噪比AdeqPrecision=13.372>4，表明該模型的擬合度和可信度極高。由各單項的F值可以看出，分析條件對多酚提取影響程度從大到小依次為A（微波時間）、C（超聲功率）、B（提取溫度）。從二次項F值可以看出A2、B2和C2對響應值的差異極顯著，F(xiàn)值普遍較高，而且在回歸方程中，這3項的系數(shù)均為負值，說明超過此因素的最大值時，隨著微波時間、提取溫度、超聲功率的增大，其提取率會下降，此結論與單因素試驗結果相符。在此模型中，A2、B2和C2對蒲公英多酚的提取影響極顯著。由圖8可見，AB對蒲公英多酚提取的影響顯著，其他均為不顯著，由此可以看出各試驗條件對于多酚提取的影響不是單純的線性關系。從交互項來看，AC、BC的F值均較小，說明其對多酚提取率的影響不顯著，所以超聲功率對多酚得率的影響是相對獨立的。

2.3蒲公英多酚抗氧化活性研究

2.3.1DPPH自由基清除能力的測定。由圖9可見，蒲公英多酚提取物有清除DPPH自由基的能力，在多酚溶液濃度升高時，對DPPH的清除能力增大。多酚濃度為0.01～0.03mg/mL時對DPPH自由基的清除較快;在0.03～0.09mg/mL時對DPPH自由基的清除較緩慢。

2.3.2ABTS自由基清除能力的測定。

由圖10可知，蒲公英多酚提取物對ABTS自由基有一定的清除能力，并且隨著多酚溶液濃度的升高，ABTS的清除率增大?？傮w來說，多酚提取物濃度的增大，清除ABTS自由基速度較DPPH自由基增加迅速。

2.3.3鐵離子還原力的測定。蒲公英多酚提取物還原鐵離子強度與吸光度呈正相關，從圖11可以看出隨著多酚提取物濃度的增加，吸光度逐漸增加，還原鐵離子強度也逐漸增強，并且趨近于線性增長。

3結論

根據單因素試驗及響應面試驗結果，得出超聲波微波提取蒲公英多酚的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶45、微波功率350W、超聲時間60min、微波時間3.18min、提取溫度49.22℃、超聲功率237.47W，根據上述因素蒲公英多酚提取率為2.88%，實際值為2.96%。說明此試驗方法可以用來進行蒲公英多酚的提取?？紤]到實際操作，微波時間、提取溫度、超聲功率可依次調節(jié)為3min、50℃、240W。

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