非復(fù)制型弓形蟲(chóng)的構(gòu)建及其對(duì)小鼠致病性分析

任 超 王超越 劉賢勇 索 勛*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193； 2.天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院/天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

敲除弓形蟲(chóng)的氨甲酰基磷酸合成酶II(Carbamoyl phosphate synthetase II，CPSII)基因，阻斷嘧啶從頭合成途徑，構(gòu)建cps1-1蟲(chóng)株，能夠激發(fā)宿主產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力，成為潛在的弓形蟲(chóng)減毒活疫苗[1]，但是由于cps1-1蟲(chóng)株存在嘧啶補(bǔ)救途徑，能夠在機(jī)體內(nèi)緩慢增殖，蟲(chóng)體的毒力會(huì)有返強(qiáng)的機(jī)會(huì)，臨床應(yīng)用會(huì)存在極大的風(fēng)險(xiǎn)。為此，2010年Bzik研究團(tuán)隊(duì)將弓形蟲(chóng)的乳清酸核苷-5’-單磷酸脫羧酶(Orotidine-5’-monophosphate decarboxylase，OMPDC)和尿嘧啶核苷磷酸化酶(Uridine phosphorylase，UP)基因進(jìn)行雙敲除，不僅阻斷了嘧啶從頭合成途徑，而且通過(guò)體外調(diào)節(jié)尿嘧啶的濃度，能夠控制嘧啶補(bǔ)救途徑，獲得非復(fù)制型尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型弓形蟲(chóng)(Nonreplicating toxoplasma uracil auxotrophs，NRTUAs)[2-3]。

NRTUAs具有獨(dú)特的表型，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)不能增殖，只能入侵機(jī)體細(xì)胞，而NRTUAs只有在體外添加尿嘧啶的培養(yǎng)基中才能正常裂殖生殖，否則只能入侵細(xì)胞，不能增殖，進(jìn)而降低弓形蟲(chóng)的毒力和致病性，為臨床應(yīng)用提供安全保障[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，NRTUAs能夠調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)，激發(fā)宿主產(chǎn)生針對(duì)弓形蟲(chóng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且免疫蟲(chóng)體經(jīng)過(guò)5 d左右就能被機(jī)體的免疫系統(tǒng)清除[4-5]。與細(xì)菌和病毒疫苗載體相比，NRTUAs首次免疫1萬(wàn)個(gè)蟲(chóng)體就可以激發(fā)宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，對(duì)抗野生型弓形蟲(chóng)的再感染[6-8]，說(shuō)明NRTUAs可作為潛在的弓形蟲(chóng)候選疫苗株，未來(lái)有希望應(yīng)用于家畜養(yǎng)殖業(yè)。雖然NRTUAs在小鼠體內(nèi)可被清除，但如果大劑量免疫NRTUAs，宿主細(xì)胞是否會(huì)將所有的蟲(chóng)體清除？局部組織器官是否會(huì)發(fā)生病理變化？因此，確定NRTUAs的致病性至關(guān)重要。

本研究以△KU80株為背景蟲(chóng)株，利用CRISPR-Cas9技術(shù)，對(duì)OMPDC和UP基因進(jìn)行雙敲除，構(gòu)建NRTUAs蟲(chóng)株，鑒定NRTUAs的表型并將NRTUAs株感染小鼠，通過(guò)分析NRTUAs株對(duì)小鼠的致死性以及各器官的病理變化來(lái)研究NRTUAs對(duì)小鼠的致病性，為NRTUAs在家畜養(yǎng)殖中作為抗弓形蟲(chóng)疫苗株的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

5周齡SPF級(jí)昆明小鼠60只，體重為20±2 g，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼料充足，飲水不限，健康狀況良好。

1.1.2細(xì)胞與蟲(chóng)株

非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)和△KU80株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物寄生原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1敲除載體的構(gòu)建

參考Toxo DB數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.toxodb.org)中RH蟲(chóng)株的基因組信息，應(yīng)用http:∥grna.ctegd.uga.edu/網(wǎng)站設(shè)計(jì)OMPDC基因和UP基因的特異single guide RNA(sgRNA)序列。然后以pSAG1::Cas9 GFP-U6::sgUPRT為模板，分別通過(guò)引物gOMPDC-F/R和gUP-F/R以PCR擴(kuò)增的方式替換模板質(zhì)粒中的sgUPRT，獲得識(shí)別OMPDC和UP靶點(diǎn)的敲除質(zhì)粒；分別利用引物KO OMPDC-F1/R1/F2/R2和KO UP-F1/R1/F2/R2來(lái)擴(kuò)增獲得OMPDC和UP基因的5’UTR和3’UTR同源臂，并將OMPDC基因5’UTR、DHFR-YFP和OMPDC基因3’UTR3個(gè)片段連接，構(gòu)建用于替代阻斷OMPDC編碼區(qū)的同源重組模板，同時(shí)將UP基因5’UTR、CAT-mCherry和UP基因3’UTR3個(gè)片段連接，構(gòu)建用于替代阻斷UP編碼區(qū)的同源重組模板。

1.2.2敲除蟲(chóng)株ΔUP的獲得與篩選鑒定

將弓形蟲(chóng)ΔKU80蟲(chóng)株進(jìn)行富集和純化，溶于適量電轉(zhuǎn)液，使蟲(chóng)體的終濃度為2×107個(gè)/mL。調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)儀，參數(shù)為2 050 V電壓，電阻無(wú)窮大，電容25 μF，使用4 mm電轉(zhuǎn)杯。取700 μL蟲(chóng)體加入電轉(zhuǎn)杯中，將10 μg敲除質(zhì)粒和50 μg同源重組模板加入電轉(zhuǎn)杯中混勻，將電轉(zhuǎn)杯放入安全操作池，啟動(dòng)程序，電轉(zhuǎn)完畢后，電轉(zhuǎn)杯靜止20 min。將電轉(zhuǎn)完畢的弓形蟲(chóng)加入新鮮培養(yǎng)的HFF細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，加入終質(zhì)量濃度為 50 pg/mL 的氯霉素進(jìn)行初步篩選，接種后每天觀察各孔蟲(chóng)株生長(zhǎng)狀態(tài)，傳至第六代時(shí)，可以觀察到紅色熒光和噬斑出現(xiàn)；當(dāng)紅色熒光和噬斑出現(xiàn)比例占細(xì)胞80%面積時(shí)，用細(xì)胞刷刮起細(xì)胞，注射器反復(fù)推注破碎細(xì)胞釋放弓形蟲(chóng)，收集弓形蟲(chóng)繼續(xù)進(jìn)行氯霉素篩選傳代，當(dāng)敲除蟲(chóng)體的發(fā)光率穩(wěn)定時(shí)，說(shuō)明替換模板已成功插入弓形蟲(chóng)的基因組中，然后通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行單克隆蟲(chóng)株的篩選，接種到96孔板內(nèi)培養(yǎng)，直至蟲(chóng)株長(zhǎng)成噬斑，挑出UP基因缺失的單克隆抗性蟲(chóng)株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取敲除蟲(chóng)株的基因組，利用引物UP 5-F/R和UP 3-F/R進(jìn)行重組同源臂上下游PCR鑒定，利用引物UP I1-F/R和UP I2-F/R進(jìn)行內(nèi)源性UP位點(diǎn)缺失PCR鑒定，鑒定正確的敲除蟲(chóng)株ΔUP用于OMPDC基因敲除。

1.2.3敲除蟲(chóng)株ΔOMPDC的獲得與篩選鑒定

敲除蟲(chóng)株的獲得與篩選鑒定過(guò)程同1.2.2，電轉(zhuǎn)完畢時(shí)，將弓形蟲(chóng)加入新鮮培養(yǎng)的HFF細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)液中含250 μmol/L尿嘧啶。培養(yǎng)24 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，加入濃度為1 μmol/L的乙胺嘧啶進(jìn)行初步篩選，接種后每天觀察各孔蟲(chóng)株生長(zhǎng)狀態(tài)，傳至第五代時(shí)，可以觀察到黃色熒光和噬斑；單克隆鑒定時(shí)，提取敲除蟲(chóng)株的基因組，利用引物OMPDC 5-F/R和OMPDC 3-F/R進(jìn)行重組同源臂上下游PCR鑒定，利用引物OMPDC I1-F/R和OMPDC I2-F/R進(jìn)行內(nèi)源性O(shè)MPDC位點(diǎn)缺失PCR鑒定，鑒定正確的敲除蟲(chóng)株ΔOMPDC用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4敲除蟲(chóng)株ΔOMPDCΔUP(NRTUAs)的獲得與篩選鑒定

敲除蟲(chóng)株的獲得與篩選鑒定過(guò)程同1.2.2，將弓形蟲(chóng)ΔUP株進(jìn)行富集和純化用于敲除，當(dāng)電轉(zhuǎn)完畢的弓形蟲(chóng)加入新鮮培養(yǎng)的HFF細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)液中含250 μmol/L尿嘧啶。培養(yǎng)24 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，加入終質(zhì)量濃度為50 pg/mL的氯霉素和1 μmol/L的乙胺嘧啶進(jìn)行初步篩選，接種后每天觀察各孔蟲(chóng)株生長(zhǎng)狀態(tài)，傳至第五代時(shí)，可以觀察到黃色熒光、紅色熒光和噬斑；單克隆鑒定同1.2.3，鑒定正確的敲除蟲(chóng)株NRTUAs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5噬斑試驗(yàn)

將HFF細(xì)胞鋪滿12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，收集NRTUAs株和△KU80株，分別接種70個(gè)速殖子至HFF細(xì)胞，其中，NRTUAs株和△KU80株分別接種在含有或不含250 μmol/L尿嘧啶的細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)7 d，觀察，吸棄培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗去釋放到胞外的蟲(chóng)體。每孔加入4%多聚甲醛1 mL，室溫固定20 min。每孔再加入1%結(jié)晶紫染色1～2 mL，室溫染色1 h，用PBS充分洗滌。肉眼可見(jiàn)未著色的噬斑，掃描記錄。

1.2.6非復(fù)制型弓形蟲(chóng)對(duì)小鼠的致病性研究

將雌鼠隨機(jī)分成3組，每組10只，在試驗(yàn)第0天，各組以腹腔注射的方式分別感染NRTUAs株和△KU80株，速殖子懸液濃度為107個(gè)/mL，感染劑量為0.1 mL/只，同時(shí)腹腔注射等劑量的無(wú)菌PBS為空白對(duì)照。雄鼠處理方式同雌鼠。

每日觀察各組小鼠的精神狀態(tài)，記錄死亡情況，對(duì)死亡小鼠即刻剖檢，在試驗(yàn)第40天剖檢剩余小鼠，采集所有小鼠的心臟、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、腦、卵巢或睪丸，用10%中性福爾馬林固定液進(jìn)行組織固定，按照常規(guī)方法制備病理組織切片并進(jìn)行HE染色，對(duì)小鼠各器官進(jìn)行病理組織學(xué)觀察和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除載體的構(gòu)建

以PCR擴(kuò)增方式替換模板質(zhì)粒中的sgUPRT，分別獲得識(shí)別OMPDC和UP靶點(diǎn)的sgRNA基因片段(圖1(a))，用于構(gòu)建OMPDC和UP基因的敲除質(zhì)粒。

通過(guò)PCR擴(kuò)增，分別獲得OMPDC和UP基因的5’UTR和3’UTR同源臂(圖1(b))，并進(jìn)一步構(gòu)建替代阻斷OMPDC和UP編碼區(qū)的同源重組模板(圖1(c))。

2.2 敲除蟲(chóng)株ΔUP的獲得與篩選鑒定

分別提取NRTUAs株和△KU80株的基因組DNA為模板，NRTUAs株以引物OMPDC 5-F/R和OMPDC 3-F/R鑒定均為陽(yáng)性，△KU80株均為陰性；NRTUAs株以引物OMPDC I1-F/R和OMPDC I2-F/R鑒定均為陰性，△KU80株均為陽(yáng)性，說(shuō)明NRTUAs株針對(duì)OMPDC基因的同源臂與基因組發(fā)生同源重組，OMPDC基因敲除成功(圖1(d))；NRTUAs株以引物UP 5-F/R和UP 3-F/R鑒定均為陽(yáng)性，△KU80株均為陰性；NRTUAs株以引物UP I1-F/R和UP I2-F/R鑒定均為陰性，△KU80株均為陽(yáng)性，說(shuō)明NRTUAs株針對(duì)UP基因的同源臂與基因組發(fā)生同源重組，UP基因敲除成功(圖1(e))。

熒光倒置顯微鏡下觀察，ΔOMPDC株自發(fā)黃色熒光，對(duì)乙胺嘧啶產(chǎn)生抗藥性(圖2(a))；ΔUP株自發(fā)紅色熒光，對(duì)氯霉素產(chǎn)生抗藥性(圖2(b))； NRTUAs株自發(fā)黃色和紅色雙熒光，能夠?qū)σ野粪奏ず吐让顾禺a(chǎn)生抗藥性(圖2(c))，說(shuō)明OMPDC和UP基因敲除成功。

2.3 敲除蟲(chóng)株的表型鑒定

噬斑試驗(yàn)主要用于評(píng)價(jià)弓形蟲(chóng)在細(xì)胞內(nèi)的整體生長(zhǎng)情況。NRTUAs在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中不能形成噬斑，當(dāng)培養(yǎng)基中添加尿嘧啶后，NRTUAs能夠形成噬斑，而無(wú)論培養(yǎng)基中是否含有尿嘧啶，△KU80株均能形成噬斑(圖3)。上述結(jié)果說(shuō)明OMPDC和UP基因雙敲除抑制弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體的生長(zhǎng)，通過(guò)體外尿嘧啶供給，能夠恢復(fù)敲除蟲(chóng)體的生長(zhǎng)能力。

(a)ΔOMPDC株自發(fā)黃色熒光，在含有乙胺嘧啶的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)；(b)ΔUP株自發(fā)紅色熒光，在含有氯霉素的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)；(c)NRTUAs株自發(fā)黃色和紅色雙熒光，在含有乙胺嘧啶和氯霉素的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)。比例尺=20 μm(a) ΔOMPDC strains spontaneously fluorescing yellow can replicate in the medium with pyrimidine； (b) ΔUP strains spontaneously fluorescing red can replicate in the medium with chloramphenicol； (c) NRTUAs strains spontaneously fluorescing yellow and red can replicate in the medium with pyrimidine and chloramphenicol. Bar=20 μm圖2 敲除蟲(chóng)株的篩選Fig.2 Screening of knockout strains

圖3 敲除蟲(chóng)株的表型鑒定Fig.3 Phenotypic identification of knockout strain

2.4 非復(fù)制型弓形蟲(chóng)對(duì)小鼠的致病性分析

雌鼠在感染后0～40 d內(nèi)，NRTUAs組和PBS組均無(wú)小鼠死亡，生存率為100%；△KU80組在感染后第4、5和6天分別出現(xiàn)6、3和1只小鼠死亡，生存率均為0(圖4(a))。雄鼠在感染后0～40 d內(nèi)，NRTUAs組和PBS組均無(wú)小鼠死亡，生存率為100%；△KU80組在感染后第3、4、6天分別出現(xiàn)2、6、2只小鼠死亡，生存率均為0(圖4(b))。上述結(jié)果說(shuō)明NRTUAs蟲(chóng)株對(duì)小鼠無(wú)致死性。

2.5 非復(fù)制型弓形蟲(chóng)對(duì)小鼠各器官的病理分析

小鼠心臟病理組織學(xué)分析，各組的心肌纖維排列規(guī)整，胞漿豐富，胞質(zhì)和胞核染色均勻，細(xì)胞間無(wú)充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5)。

小鼠肺臟病理組織學(xué)分析，NRTUAs組和PBS組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁和各級(jí)支氣管結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔和各級(jí)支氣管腔內(nèi)無(wú)滲出物，各級(jí)支氣管的粘膜上皮無(wú)變性壞死脫落，肺泡間隔未增厚，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁毛細(xì)血管內(nèi)少量紅細(xì)胞；△KU80組肺泡間隔、支氣管和血管周圍充血、水腫，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞和網(wǎng)狀纖維增生，部分細(xì)胞發(fā)生腫脹變性，壞死崩解，形成小壞死灶和肺泡間隔炎，使肺間質(zhì)增寬，呈現(xiàn)間質(zhì)性肺炎病變(圖5)。

(a)雌鼠感染NRTUAs的生存情況；(b)雄鼠感染NRTUAs的生存情況(a) Survival of female mice infected with NRTUAs； (b) Survival of male mice infected with NRTUAs strains圖4 小鼠感染NRTUAs的生存曲線Fig.4 Survival of mice infected with NRTUAs

小鼠肝臟病理組織學(xué)分析，NRTUAs組和PBS組的肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索和肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞呈多邊形，核居中，肝臟被膜及匯管區(qū)小葉間動(dòng)脈、小葉間靜脈和小葉間膽管無(wú)明顯病變；△KU80組肝臟小葉間靜脈、葉下靜脈和肝血竇淤血，肝臟呈現(xiàn)局灶性壞死，肝細(xì)胞核發(fā)生核濃縮、核碎裂和核溶解，導(dǎo)致原有組織結(jié)構(gòu)不清楚，呈一片模糊紅染無(wú)結(jié)構(gòu)的狀態(tài)，在壞死灶周圍以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，在壞死灶附近的肝細(xì)胞發(fā)生顆粒變性、水樣變性或脂肪變性(圖5)。

小鼠腎臟病理組織學(xué)分析，NRTUAs組和PBS組的腎臟皮質(zhì)髓質(zhì)分界清晰，組織結(jié)構(gòu)完整，腎小球形狀規(guī)則，腎小管輪廓清楚，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，無(wú)變性壞死細(xì)胞；△KU80組腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性、水泡變性和壞死，部分壞死組織碎片脫落入管腔，局部出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5)。

小鼠脾臟病理組織學(xué)分析，NRTUAs組和PBS組脾臟結(jié)構(gòu)分明，紅髓和白髓分界清楚，脾細(xì)胞排列規(guī)則，中央動(dòng)脈周圍密布淋巴細(xì)胞；△KU80組脾臟原有結(jié)構(gòu)消失，紅髓充盈大量血液，脾臟內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生變性壞死，脾小梁的結(jié)締組織和平滑肌纖維也出現(xiàn)不同程度的腫脹和溶解(圖5)。

小鼠胸腺病理組織學(xué)分析，NRTUAs組和PBS組胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)分明，皮質(zhì)較厚，密布胸腺細(xì)胞，染色較深，髓質(zhì)含有很多上皮細(xì)胞，染色較淺；△KU80組胸腺的正常組織結(jié)構(gòu)消失，胸腺內(nèi)淤血，實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生變性壞死(圖5)。

小鼠大腦病理組織學(xué)分析，NRTUAs組和PBS組腦組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞胞漿透明，細(xì)胞核居中，呈圓形或橢圓形，核仁清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)無(wú)水腫；△KU80組軟腦膜及腦組織中血管充血，軟腦膜及淺層腦組織有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，淺層腦組織液化壞死，在變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞周圍可見(jiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞呈彌漫性或局灶性增生，局部性增生的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞聚集成大小不等的集團(tuán)，形成膠質(zhì)細(xì)胞小結(jié)(圖5)。

雌鼠卵巢病理組織學(xué)分析，NRTUAs組和PBS組卵巢組織結(jié)構(gòu)層次清晰，卵泡數(shù)量豐富，各級(jí)卵泡輪廓清晰可見(jiàn)，并有大量黃體分布；△KU80組卵巢組織呈現(xiàn)凝固性壞死，卵泡和黃體的細(xì)胞發(fā)生變性壞死，結(jié)締組織增生(圖5)。

雄鼠睪丸病理組織學(xué)分析，NRTUAs組和PBS組睪丸曲細(xì)精管管壁完整，上皮細(xì)胞排列緊密，各級(jí)生精細(xì)胞排列整齊而規(guī)則，官腔內(nèi)可見(jiàn)數(shù)量不等的精子，曲細(xì)精管之間結(jié)締組織結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞；△KU80組睪丸組織呈現(xiàn)凝固性壞死，曲細(xì)精管管腔內(nèi)成熟精子減少或消失，僅見(jiàn)精原細(xì)胞及初級(jí)精母細(xì)胞層，呈生精停滯的狀態(tài)，大量生精細(xì)胞發(fā)生變性壞死，壞死細(xì)胞碎片存在于曲細(xì)精管官腔中，睪丸間質(zhì)細(xì)胞壞死，結(jié)締組織增生，充血(圖5)。

卵巢比例尺=180 μm，其他器官比例尺=90 μm Ovary bar=180 μm, Others=90 μm圖5 NRTUAs感染小鼠各器官的病理變化Fig.5 Pathological changes of organs in mice infected with NRTUAs

3 討 論

本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)，分別設(shè)計(jì)OMPDC基因和UP基因的特異sgRNA序列，構(gòu)建識(shí)別OMPDC和UP靶點(diǎn)的敲除質(zhì)粒，提高敲除效率；在同源重組模板中，通過(guò)添加抗藥基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)和紅色熒光基因(mCherry)來(lái)提升UP基因的敲除效率，通過(guò)添加抗藥基因二氫葉酸還原酶(DHFR)和黃色熒光蛋白基因(YFP)來(lái)提升OMPDC基因的敲除效率，在研究方法上比2010年Bzik研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建NRTUAs株的篩選效率更高[2]。

尿苷-5′-單磷酸(UMP)是弓形蟲(chóng)三磷酸尿苷(UTP)合成的重要上游物質(zhì)，UMP的合成影響DNA和RNA的合成，進(jìn)而影響弓形蟲(chóng)的增殖[1-2]。UMP的合成有2個(gè)重要的途徑，分別是嘧啶從頭合成途徑與嘧啶補(bǔ)救途徑，OMPDC和UP分別是這2個(gè)途徑中的關(guān)鍵酶[9]。缺失OMPDC基因，UMP從頭合成途徑被阻斷，蟲(chóng)體不能利用自身代謝產(chǎn)物合成UMP；而缺失UP基因，嘧啶補(bǔ)救途徑被阻斷，蟲(chóng)體不能利用宿主的核苷酸代謝產(chǎn)物合成UMP[3]。當(dāng)體外添加尿嘧啶時(shí)，在尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的作用下尿嘧啶生成UMP，使蟲(chóng)體能夠繼續(xù)增殖，因此，在噬斑試驗(yàn)中，未加尿嘧啶的培養(yǎng)基，NRTUAs株不增殖，未見(jiàn)噬斑形成，而添加尿嘧啶的培養(yǎng)基，NRTUAs株能夠增殖，說(shuō)明構(gòu)建的NRTUAs株不能在體外增殖，而NRTUAs株在添加尿嘧啶的培養(yǎng)基中能夠增殖，與2010年Bzik研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的NRTUAs表型一致[2]。

弓形蟲(chóng)RH株為Ⅰ型強(qiáng)毒株，昆明小鼠對(duì)RH株非常敏感，其感染性強(qiáng)，急性致死率高[10]?！鱇U80株保留了RH株的毒力和致病性，對(duì)昆明小鼠的致死性極強(qiáng)[11]，所以感染△KU80株的小鼠，6日內(nèi)全部死亡。NRTUAs株保留了RH株的抗原性和入侵有核細(xì)胞的能力，但不能在小鼠體內(nèi)增殖，進(jìn)一步降低了NRTUAs株對(duì)小鼠的致死性[3]。在本研究中，NRTUAs株腹腔感染小鼠，40 d 內(nèi)未見(jiàn)異常，生存率為100%，且NRTUAs組與PBS組的各器官組織學(xué)形態(tài)一致，初步證實(shí)構(gòu)建的NRTUAs對(duì)小鼠無(wú)致死性，且感染NRTUAs的小鼠各器官無(wú)病理變化。

綜上所述，本研究以△KU80株為背景蟲(chóng)株，利用CRISPR-Cas9技術(shù)，通過(guò)導(dǎo)入熒光基因和抗藥基因共同篩選，PCR鑒定獲得NRTUAs蟲(chóng)株，噬斑試驗(yàn)表明本次構(gòu)建的NRTUAs表型與2010年Bzik研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的NRTUAs表型一致，感染NRTUAs的小鼠全部存活，各器官無(wú)病理變化，說(shuō)明NRTUAs對(duì)小鼠安全性較高，為NRTUAs在家畜養(yǎng)殖中作為抗弓形蟲(chóng)疫苗株進(jìn)行深入研發(fā)提供參考。