BRCA1和人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況

楊天真 楊 軍 邱瑞成 王春梅

(四川省綿竹市人民醫(yī)院病理科，綿竹市 618200，電子郵箱：yangs_book@163.com)

非小細(xì)胞肺癌約占全球癌癥死因的80%，發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤首位[1]。部分非小細(xì)胞肺癌患者確診時(shí)已為中晚期，已經(jīng)不能進(jìn)行手術(shù)治療，化療或放療是治療此類患者的主要方法。因體質(zhì)的差異，不同患者對(duì)放療、化療的敏感性存在很大差異，根據(jù)生物標(biāo)記物為患者選擇合適的治療方案不但可以提高療效，還可以減少不必要的毒副作用[2]。BRCA1蛋白是一種抑癌因子，參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，臨床上常用于非小細(xì)胞肺癌的診斷和預(yù)后判斷[3]。人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3(human mitochondrial transcription termination factor 3，hMTERF3)基因編碼的蛋白質(zhì)，屬于一種負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子，可以在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合啟動(dòng)子的序列元件，抑制基因轉(zhuǎn)錄，降低線粒體呼吸鏈酶活性[4]。本研究探究BRCA1和hMTERF3在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況及其與患者病理特征的相關(guān)性，旨在為非小細(xì)胞肺癌患者的治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年10月至2018年10月在我院接受手術(shù)治療的70例非小細(xì)胞肺癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)過手術(shù)病理確診；所有患者均符合2014版《NCCN非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》[5]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：病歷資料不全者；心腎肺等功能不完全者；心腦血管疾病患者；并發(fā)其他惡性腫瘤患者。其中男性38例、女性32例，年齡48～69(57.3±7.6)歲；病理分期Ⅰ期12例，Ⅱ期22例，Ⅲ期20例，Ⅳ期16例。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本制作：術(shù)中留取癌組織標(biāo)本以及距離癌組織5 cm以上的癌旁組織標(biāo)本，使用4%中性福爾馬林固定后行常規(guī)石蠟包埋，厚度為3 cm，連續(xù)切片作免疫組化標(biāo)記。

1.2.2 免疫印跡法檢測(cè)BRCA1、hMTERF3蛋白表達(dá)水平：取癌組織與癌旁組織標(biāo)本，磷酸緩沖鹽溶液清洗標(biāo)本3次后，采用分離緩沖液裂解0.5 h獲取蛋白，測(cè)定蛋白濃度。以20 μg/孔蛋白質(zhì)上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用10%的牛奶將轉(zhuǎn)有蛋白的膜在搖床上常溫封閉1.5 h；BRCA1(Abgent公司，批號(hào)：A-AO1812a，)、hMTERF3(Abnova公司，批號(hào)：H00050650-M)一抗孵育(稀釋比均為1 ∶1 000)37℃過夜，TBST洗膜后室溫孵育BRCA1、hMTERF3二抗(Hycult公司，批號(hào)：HM1002-01、HM1002-08；稀釋比均為1 ∶5 000)1 h，TBST洗膜后，加入顯影劑顯色(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：WB-0312)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 免疫組化染色：將待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行脫蠟、水化后，浸泡在95℃ 0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液中，并進(jìn)行熱修復(fù)，3%的H2O2培育20 min后，滴入山羊血清10 min后進(jìn)行封閉，在25℃～27℃環(huán)境下孵育30 min，棄封閉液，加入BRCA1(Abgent公司，批號(hào)：A-AO1812a)、hMTERF3(Abnova公司，批號(hào)：H00050650-M)一抗，5℃孵育過夜，次日加入BRCA1、hMTERF3二抗(Hycult公司，批號(hào)：HM1002-01，HM1002-08)，37℃恒溫箱中孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺顯色、脫水、封片處理。所有病理切片均由2位以上經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行觀察并作出診斷。隨機(jī)選擇5個(gè)視野，根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)估：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為(-)，10%～25%為(+)，>25%～75%為(++)，>75%為(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織和癌旁組織中BRCA1、hMTERF3蛋白表達(dá)水平的比較 BRCA1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，陽(yáng)性表現(xiàn)呈棕褐色或淺褐色；hMTERF3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性表現(xiàn)為棕褐色或褐色。癌組織中BRCA1、hMTERF3蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于癌旁組織(均P<0.05)，見表1和圖1、圖2。

表1 癌組織、癌旁組織中BRCA1、hMTERF3蛋白相對(duì)表達(dá)水平的對(duì)比(x±s)

圖1 BRCA1和hMTERF3蛋白在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

圖2 癌組織及癌旁組織中BRCA1和hMTERF3蛋白的免疫組化染色結(jié)果(×200)注：圖A、B分別為癌組織中BRCA1和hMTERF3蛋白癌旁組織的BRCA1檢測(cè)免疫組織化結(jié)果，圖C、D分別為癌組織、癌旁組織的hMTERF3檢測(cè)免疫組化結(jié)果。

2.2 不同病理特征患者癌組織中BRCA1、hMTERF3蛋白表達(dá)水平比較 侵及漿膜、腫瘤體積≥5 cm3、病理分期為Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化的患者BRCA1、hMTERF3蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別高于未侵及漿膜、腫瘤體積<5 cm3、病理分期為Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中或高分化的患者(均P<0.05)，見表2。

表2 不同病理特征患者癌組織中BRCA1、hMTERF3蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

據(jù)最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，肺癌的發(fā)病率、死亡率位居全球癌癥首位[6-7]，嚴(yán)重影響人類健康。在我國(guó)，肺癌屬于高發(fā)病，發(fā)病率、死亡率一直居高不下，在癌癥死亡病因中位居第一，并且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)[8]。非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的85%[9]，但部分非小細(xì)胞肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)屬于晚期，手術(shù)切除已經(jīng)無法有效根治，只能通過化療或放療改善患者癥狀[10]。但因個(gè)體差異，術(shù)后輔助化療、放療或單獨(dú)化療、放療的個(gè)體獲益有所不同[11-12]。尋找肺癌放療、化療的敏感性和耐藥性相關(guān)基因，有助于對(duì)肺癌患者進(jìn)行個(gè)體化治療，從而減少毒副作用、提高治療效果[13-14]。

有研究顯示，BRCA1、表皮生長(zhǎng)因子受體、胸苷酸合成酶等分子標(biāo)志物在預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌放療、化療敏感性等方面具有重要意義，在指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌患者個(gè)體化治療中發(fā)揮著重要作用[15]。BRCA1基因作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，C末端有酸性氨基酸，N末端有鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)，是一種與雙鏈DNA損傷修復(fù)相關(guān)的抑癌基因[16]。BRCA1基因所編碼的蛋白在DNA的損傷修復(fù)中扮演著重要角色，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、周期調(diào)控等過程[17]。在評(píng)估非小細(xì)胞肺癌化療藥物的療效時(shí)，BRCA1表達(dá)水平是非常重要的參考指標(biāo)。有研究顯示，化療藥物的療效與BRCA1表達(dá)水平有關(guān)，如BRCA1基因呈低表達(dá)的肺癌患者對(duì)鉑類藥物較為敏感，BRCA1基因呈高表達(dá)時(shí)則機(jī)體易耐藥[18]。因此，了解BRCA1因子的特點(diǎn)及其在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況，對(duì)選擇敏感的化療藥物有重要意義[19]。

hMTERF3基因定位于人類第8號(hào)染色體長(zhǎng)臂，是唯一一個(gè)人類線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子，其由10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子組成[20]。hMTERF3基因編碼的蛋白產(chǎn)物共有417個(gè)氨基酸，其在人類惡性腫瘤、線粒體糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等線粒體相關(guān)疾病的診斷與治療中均具有重要的臨床意義[21]。

本研究結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，非小細(xì)胞肺癌組織中BRCA1、hMTERF3呈現(xiàn)異常高表達(dá)，腫瘤體積大、侵及漿膜、病理分期為Ⅲ及Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化的非小細(xì)胞肺癌患者BRCA1、hMTERF3蛋白相對(duì)表達(dá)水平更高(P<0.05)，說明BRCA1、hMTERF3可能與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，BRCA1、hMTERF在非小細(xì)胞肺癌組織中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，且與病理參數(shù)具有一定相關(guān)性，兩者或在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。