IL-6/STAT3信號通路在百草枯中毒急性肺損傷中作用機制的研究

李激文 鐘雨 劉華 蔡能斌 黃俊杰 韋雪花 鄧旺生 黎宇

【摘要】 目的 探討IL-6/STAT3信號通路在百草枯中毒急性肺損傷中的作用。

方法 選取72例百草枯中毒患者，根據(jù)Murray肺損傷評分分為無肺損傷組、輕微-中度肺損傷組、重度肺損傷組，每組24例，同時收集22名健康者作為對照。支氣管肺泡灌洗、AM分離及培養(yǎng)后，ELISA檢測血清IL-6、sIL-6R、sgp130的蛋白表達，Westernblot檢測STAT3、pSTAT3、gp130的蛋白表達，RT-PCR分析STAT3、gp130mRNA表達。

結(jié)果 輕微-中度肺損傷組、重度肺損傷組IL-6、sIL-6R、sgp130、STAT3、pSTAT3、gp130的蛋白表達明顯高于無肺損傷組、對照組（P<0.05），且重度肺損傷組IL-6、sIL-6R、sgp130、STAT3、pSTAT3、gp130蛋白表達水平明顯高于輕微-中度肺損傷組（P<0.05）;重度肺損傷組STAT3mRNA、gp130mRNA表達高于其他三組（P<0.05）。

結(jié)論 百草枯中毒肺損傷患者中IL-6/STAT3信號通路通過上調(diào)sgp130、gp130蛋白的表達，升高炎癥反應(yīng)程度，對肺組織造成損傷。

【關(guān)鍵詞】 百草枯;急性肺損傷;肺泡灌洗;白介素-6;信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3

中圖分類號：R595.4?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.03.003

Study on the mechanism of IL-6/STAT3 signaling pathway in acute lung injury induced by paraquat poisoning

LI Jiwen， ZHONG Yu， LIU Hua， CAI Nengbin， HUANG Junjie， WEI Xuehua， DENG Wangsheng， LI Yu

（Emergency Department， Liuzhou Workers' Hospital， Liuzhou 545005， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the role of IL-6/STAT3 signaling pathway in acute lung injury induced by paraquat poisoning.

Methods 72 patients with paraquat poisoning were selected， and they were divided into three groups according to Murray lung injury score： non lung injury group， mild to moderate lung injury group and severe lung injury group， with 24 cases in each group， and other 22 healthy people in the same period were selected as control group. Then， after bronchoalveolar lavage， AM isolation and culture， the protein expressions of serum IL-6， sIL-6R and sgp130 were detected by ELISA， the protein expressions of STAT3， pSTAT3 and gp130 were detected by Western blot， and the mRNA expressions of STAT3 and gp130 were analyzed by RT-PCR.

Results The protein expressions of IL-6， sIL-6R， sgp130， STAT3， pSTAT3 and gp130 in the mild to moderate lung injury group and severe lung injury group were higher than those in the non lung injury group and the control group （P < 0.05）， and the expression levels of IL-6， sIL-6R， sgp130， STAT3， pSTAT3 and gp130 protein in the severe lung injury group were higher than those in the mild to moderate lung injury group （P < 0.05）. In addition， STAT3mRNA and gp130mRNA expressions in the severe lung injury group were higher than those in the other three groups （P < 0.05）.

Conclusion IL-6/STAT3 signaling pathway can increase the degree of inflammatory reaction by up regulating the expressions of sgp130 and gp130 protein in patients with lung injury induced by paraquat poisoning.

【Key words】 paraquat; acute lung injury; alveolar lavage; IL-6; STAT3

百草枯（paraquat，PQ）中毒，由于其組織擴散能力極強，致死劑量又非常小，人體中血液濃度達40 mg/kg左右即為致死劑量，當今臨床缺少特效解毒藥物，使得PQ中毒的死亡率高達80%，以其高死亡率成為我國重大公共衛(wèi)生與社會問題[1]。PQ中毒致急性肺損傷（ALI）的相關(guān)分子機制的研究涉及的信號通路較多，且各信號通路間存在交互作用，許多具體過程目前仍不清楚[2]，IL-6/STAT3信號通路參與了不同病因?qū)е碌腁LI的病理生理過程，關(guān)于其病理機制的研究結(jié)果尚無統(tǒng)一定論[3]。本研究以IL-6/STAT3信號通路為研究對象，對PQ中毒后ALI機體損傷機制進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月～2020年1月我院收治的72例PQ中毒患者作為研究對象，全部患者均口服20%百草枯原液，劑量為20～80 mL，入院時表現(xiàn)為口咽部疼痛、惡心、嘔吐、腹痛、黏膜損傷等癥狀，無肺損傷組24例，男性13例，女性11例，年齡13～61歲，平均（34.85±4.16）歲;輕微-中度肺損傷組24例，男性14例，女性10例，年齡12～62歲，平均（34.33±4.20）歲;重度肺損傷組24例，男性11例，女性13例，年齡14～62歲，平均年齡（34.54±4.13）歲。同時收集22名健康者作為對照組，男性12名，女性10名，年齡12～62歲，平均（34.22±4.13）歲;四組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 ALI/ARDS診斷及Murray肺損傷評分標準

依據(jù)1994年歐美聯(lián)席會議ALI/ARDS診斷標準[4]：（1）急性起病;（2）氧和指數(shù)（PaO2/FiO2）≤200 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），不管吸呼末正壓（PEEP）水平;（3）正位X線胸片顯示雙肺均有斑片狀陰影;（4）肺動脈嵌頓壓≤18 mmHg或無左心房壓力增高。根據(jù)Murray肺損傷評分標準分為：①0分，無肺損傷組;②0.25～2.5分，輕微-中度肺損傷組;③>2.5分，重度肺損傷組。

1.3 納入和排除標準

納入標準：（1）所有研究對象對于本次研究內(nèi)容知情并同意;（2）患者服藥前無呼吸道疾病，如慢性非阻塞性肺疾病等;（3）研究組患者入院時臨床預估其存活時間在24 h以上。排除標準：（1）患者為妊娠期女性;（2）患者伴有嚴重氣胸情況;（3）患者存在造成肺部組織損傷的原發(fā)疾病;（4）患者家屬不愿參與本次研究。本次研究已獲得醫(yī)學倫理委員會批準。

1.4 研究方法

1.4.1 抽取各組外周血

入院確診后立即抽取各組外周血10 mL，應(yīng)用Ficoll分層液法分離外周血獲取血清及外周血單核細胞-70℃留存。

1.4.2 支氣管肺泡灌洗、AM分離及培養(yǎng)

應(yīng)用支氣管肺泡灌洗法采集各組支氣管肺泡灌洗液（BALF）20 mL，分離BALF獲取上清液及肺泡巨噬細胞（AM）立即-70℃留存。灌洗部位選擇右中葉，采用生理鹽水進行沖洗，劑量100 mL，溫度為37℃，灌洗液回收在6.7～13.3 kPa負壓下進行，并采用雙層滅菌紗布對回收的灌洗液進行過濾，進行離心處理，轉(zhuǎn)速1200 r/min，4℃下離心10分鐘，上清液收縮近5～10倍-70℃貯存待測。沉淀細胞近細胞計數(shù)及瑞氏染色分類計數(shù)后，用RPMI-1640沖洗2次，然后將AM調(diào)整至1×106/mL，加入培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2條件下貼壁1小時，去除上清及未貼壁細胞（即AM）在RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24小時，-70℃待測。

1.4.3 ELISA檢測血清IL-6、sIL-6R、sgp130的蛋白表達

嚴格按照ELISA說明書操作檢測血清上清液中IL-6、sIL-6R、sgp130的蛋白表達。

1.4.4 Westernblot檢測STAT3、pSTAT3、gp130的蛋白表達

裂解細胞得到蛋白樣品并檢測濃度，Westernblot檢測STAT3、pSTAT3、gp130蛋白表達水平。配制10%分離液，將凝膠固定在電泳裝置上，每道上樣為30 μg，進行電泳;電泳結(jié)束后，將凝膠置于轉(zhuǎn)移緩沖液中30 min;截取PVDF膜使其與凝膠大小一致，另取2張3 M濾紙，浸入轉(zhuǎn)移緩沖液使其浸透;轉(zhuǎn)移結(jié)束后將PVDF膜取出，將膜轉(zhuǎn)入新鮮配制的封閉液中4℃溫和震蕩過夜，棄掉封閉液，按照說明書加入相應(yīng)比例的一抗，再加入1∶20 000辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠二抗，TBST洗膜3次，每次5 min去除Tween-20;顯影，用Bio-Rda凝膠成像系統(tǒng)照相記錄。

1.4.5 STAT3、gp130mRNA半定量分析RT-PCR

外周血單核細胞，肺泡巨噬細胞總RNA提取，采用Trizol、氯仿一步法從細胞提取RNA，取細胞RNA1Ug，逆轉(zhuǎn)合成cDNA。SATA3反應(yīng)條件：94℃，30 s;95℃，30 s;72℃60 s;33個循環(huán)后72℃延伸10 min。gp130反應(yīng)條件：變性溫度為95℃，時間為15 min，進一步變性溫度為94℃，時間為30 s，退火溫度為51℃，時間為30 s，延伸溫度為72℃，時間為30 s，以該溫度進行33個循環(huán)，最后延伸溫度為72℃，時間為10 min。取PCR產(chǎn)物上樣于10 g/L瓊脂糖電泳，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，利用天能圖像分析系統(tǒng)測定條帶的光密度值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)? 果

2.1 IL-6、sIL-6R、sgp130的蛋白表達結(jié)果分析

重度損傷組IL-6、sIL-6R以及sgp130蛋白表達均低于輕微-中度損傷組、無肺損傷組以及對照組（P<0.05），輕微-中度肺損傷組IL-6、sIL-6R以及sgp130蛋白表達均低于無肺損傷組、對照組（P<0.05），無肺損傷組IL-6、sIL-6R以及sgp130蛋白表達低于對照組（P<0.05），隨損傷程度加重，IL-6、sIL-6R以及sgp130蛋白表達呈升高趨勢。見圖1。

2.2 STAT3、pSTAT3、gp130的蛋白表達結(jié)果分析

重度肺損傷組STAT3/β-actin、pSTAT3/β-actin 以及gp130/β-actin均高于輕微-中度肺損傷組、無肺損傷組以及對照組（P<0.05），輕微-中度肺損傷組STAT3/β-actin、pSTAT3/β-actin以及gp130/β-actin均高于無肺損傷組、對照組（P<0.05），無肺損傷組STAT3/β-actin、pSTAT3/β-actin以及gp130/β-actin高于對照組（P<0.05），PQ中毒患者STAT3/β-actin、pSTAT3/β-actin以及gp130/β-actin高于對照組，且隨肺損傷程度加重而呈現(xiàn)表達升高趨勢。見圖2、表2。

2.3 STAT3mRNA、gp130mRNA表達結(jié)果

重度肺損傷組STAT3mRNA、gp130mRNA均高于輕微-中度肺損傷組、無肺損傷組以及對照組（P<0.05），輕微-中度肺損傷組STAT3mRNA、gp130mRNA均高于無肺損傷組、對照組（P<0.05），無肺損傷組STAT3mRNA、gp130mRNA高于對照組（P<0.05），PQ中毒患者STAT3mRNA、gp130mRNA高于對照組，且隨肺損傷程度加重而呈現(xiàn)表達升高趨勢。見表3。

3 討? 論

國內(nèi)研究顯示，PQ中毒發(fā)生比例占急性農(nóng)藥中毒的33.60%左右，且呈逐年上升趨勢，死亡率也居高不下[5]。PQ中毒屬于臨床危重癥，諸多學者一直致力于其治療方案研究，也制定了眾多的專家指南共識，但是到目前為止尚無統(tǒng)一治療方案，臨床大多以洗胃、導瀉、灌腸、補液、利尿、糾正水電解質(zhì)紊亂等對癥處理方法進行治療為主[6]。究其原因，主要是因為PQ中毒機制極其復雜，至今尚未完全闡述清楚[7]。關(guān)于PQ中毒致肺損傷的相關(guān)機制主要有以下幾方面觀點：①毒物在肺組織中蓄積。PQ經(jīng)消化道、呼吸道以及皮膚等進入人體后分布在骨骼、肝臟、肺部以及腎臟位置，PQ可與胺類物質(zhì)競爭通過肺泡Ⅱ型細胞的能量依賴性多胺攝取途徑而選擇性地在肺內(nèi)聚集，其在細胞膜上可與多胺類物質(zhì)競爭而被細胞攝取。這種攝取集中于肺部Ⅱ型細胞內(nèi)，同時在器官C蠟染細胞以及肺泡Ⅰ型細胞內(nèi)存在。②氧自由基損傷。集中在肺組織以后，通過NADPH輔助單電子還原成為自由基，隨后同分子氧之間發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子以及聯(lián)吡啶陽離子，使其膜功能與結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。③脂質(zhì)過氧化損傷。在PQ12 h暴露肺泡巨噬細胞顯示脂質(zhì)過氧化物，損傷線粒體，促使重要組成部位中毒。④胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。PQ中毒以后肺組織細胞中的胞漿內(nèi)鈣離子濃度持續(xù)上升，通過實施金屬離子鰲合劑乙二胺四乙酸以后，出血以及充血情況均得到顯著緩解。⑤炎性細胞。PQ中毒早期階段存在大量免疫細胞浸潤以及炎性細胞浸潤，從而分泌大量遞質(zhì)。并且炎性細胞存在肺泡表面聚集是早期階段主要特征，將氧自由基加以釋放，防止PQ急性肺損傷。

隨著醫(yī)學研究的不斷拓展，越來越多的研究指出，在調(diào)控ALI過程中信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transduction transcription activator 3，STAT3）的激活起到非常重要的作用[8]。STAT3主要存在于胞漿中，其構(gòu)象在啟動因子的刺激下會發(fā)生改變，序列暴露后，STAT3可獲得核定位信號，促進STAT3進入細胞核內(nèi)，對于細胞增殖、分化以及凋亡等過程起到調(diào)控作用[9]。STAT3與其他分子形成的受體復合物是通過識別細胞表面糖蛋白gp130進行的，使Src、Jak等酪氨酸蛋白激酶被激活，對于STAT到受體胞質(zhì)區(qū)磷酸化的酪氨酸殘基上起到募集作用，在磷酸化TAT蛋白上的酪氨酸后進行蛋白質(zhì)激活[10]。在STAT3活化后會形成二聚體，轉(zhuǎn)位進入細胞核與DNA反應(yīng)元件進行特異性結(jié)合，使下游靶基因轉(zhuǎn)錄啟動。STAT3屬于一組多樣性蛋白質(zhì)，對于多種炎性反應(yīng)可以起到激活作用，促進肺組織的炎性損害。有報道指出，將小鼠STAT3敲除，小鼠可快速出現(xiàn)肺泡滲出情況，甚至會出現(xiàn)急性呼吸衰竭，且敲除STAT3的小鼠，炎癥反應(yīng)以及肺損傷情況都比未敲除小鼠嚴重[11]。

有報道指出，PQ中毒患者IL-18表達均高于健康對照組，且隨肺組織損傷加重呈現(xiàn)IL-18表達明顯升高情況[12]。STAT3在肺中和肺泡巨噬細胞有IgG復合物的組織均存在激活情況，但是時間框不同，其激活是靠不同因子來實現(xiàn)[13]。在IgG免疫復合物誘導的肺損傷中抗IL-6抗體對于STAT3在肺泡上皮細胞的激活起到抑制作用，因此，IL-6可能是通過激活STAT3而起到抗炎作用[14]。已有研究指出，STAT3在出血性休克以及脂多糖導致的肺損傷中也存在激活情況，IL-6不是通過脂多糖激活STAT3，而是在肺內(nèi)皮細胞以及上皮細胞上激活，對IL-6/STAT3信號通路的激活進行全面抑制，對于脂多糖導致膿毒血癥以及肺損傷可以起到有效對抗作用[15]。STAT3在出血性休克康復的大鼠肺組織中存在被激活情況，且IL-6表達水平明顯升高。也有學者研究指出，選取IL-6基因敲除大鼠以及IL-6基因轉(zhuǎn)染大鼠作為研究對象，結(jié)果顯示，重癥胰腺炎導致肺損傷大鼠存在IL-6以及IL-6受體表達升高情況，并且可通過IL-6反式信號使STAT3上調(diào)，對核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclearfactor-κ-genebinding，NF-κB）起到激活作用，加重肺組織炎性損傷[16]。

本研究表明，輕微-中度肺損傷組、重度肺損傷組IL-6、sIL-6R、sgp130、STAT3、pSTAT3、gp130的蛋白表達明顯高于無肺損傷組、對照組，且重度肺損傷組IL-6、sIL-6R、sgp130、STAT3、pSTAT3、gp130蛋白表達水平較輕微-中度肺損傷組差異有統(tǒng)計學意義;重度肺損傷組STAT3mRNA、gp130mRNA表達較其他3組，差異均有統(tǒng)計學意義。說明重度肺損傷組IL-6/STAT3信號通路被激活而表達上調(diào)，與以往研究保持一致。

綜上所述，PQ中毒肺損傷患者中IL-6/STAT3信號通路通過上調(diào)sgp130、gp130蛋白的表達，升高炎癥反應(yīng)程度，對肺組織造成損傷。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-07-07 修回日期：2021-02-03）

基金項目：廣西急診與醫(yī)學救援人才小高地、廣西高校急診醫(yī)學重點實驗室開放課題（GXJZ201623）;廣西衛(wèi)生和計劃生育委員會自籌經(jīng)費課題（Z2016181）

作者簡介：李激文，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學學士，研究方向：急救醫(yī)學、中毒。E-mail：13557025190@qq.com

通信作者：黎宇。E-mail：liyu821010@163.com

[本文引用格式]李激文，鐘雨，劉華，等.IL-6/STAT3信號通路在百草枯中毒急性肺損傷中作用機制的研究[J].右江醫(yī)學，2021，49（3）：172-177.